イオンおよび溶質輸送体の構造と機能に関する比較研究

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08680707
• Research Institution: The Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 三木 俊明 (財)東京都臨床医学総合研究所, 医化学研究部門, 研究員 (10239204)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川喜田 正夫 (財)東京都臨床医学総合研究所, 医化学研究部門, 研究員 (00012740)
• Keywords: ポリアミン / 糖ヌクレオチド / 輸送体 / cDNA / 組み替えDNA / 強制発現 / ペプチド抗体 / 赤血球

Research Abstract

ポリアミン輸送体、UDP-ガラクトース輸送体について次の研究成果を得た。
1.ポリアミン輸送系
尿中ポリアミン成分の分析から、ジアセチルポリアミンが尿路悪性腫瘍の指標として有用であることを明らかになっている。ジアセチル体は尿中より再吸収されないという結果から、尿中のジアセチル体濃度は、主に血液中のポリアミン濃度と尿細管からの分泌により規定されると考えられる。今回は血液中のポリアミンの動態について検討した。ウサギ赤血球画分は、プトレッシンを時間、温度依存的に取り込んだが、その時の取り込み速度は0〜100μMの範囲で直線的に増加した。この取り込みはスペルミン、スペルミジンが共存しても阻害されなかった。他方、スペルミジンも時間、温度依存的に取り込まれた。このスペルミジン取り込みは、スペルミン添加により70%阻害されたが、プトレッシンによっては阻害されなかった。速度論的解析の結果、スペルミジンの取り込み系は少なくとも2種類あること、そのうちの一つのKmは1.5μMであることが示された。以上の結果から、ウサギ赤血球には、スペルミン、スペルミジン特異的輸送系が存在すると考えられる。また、赤血球に解糖系の阻害剤を添加するとスペルミジンの取り込みは低下した。赤血球のポリアミン輸送系には、ATPが必要であると考えられる。
2.UDP-ガラクトース輸送体(UGT):
特異的C末ペプチド抗体を用いて免疫蛍光法による観察を行った結果、ヒトUGTタンパク質の分布は、ゴルジ装置のマーカーの分布とよい一致を示した。さらに、細胞分画を行った結果、UGTタンパク質がガラクトース転移酵素とともにゴルジ膜に局在することを、上記の免疫蛍光法による観察結果とあわせて確立した。この分画法によって得られるゴルジ膜小胞は、非特異的透過性を示さず、またright-side-outで、輸送反応の解析に適した膜標品であることも明らかになった。次に、酵母(Scharomyces cerevisiae)中でヒトUGTを発現させた。酵母の形質転換体から調製した膜画分中にUGTタンパク質が検出された。この膜画分のUTP輸送活性を測定した結果、UGTのORF導入に完全に依存した特異的輸送活性の発現が認められた。

Research Products

• [Publications] Kyouko Hiramatsu: "Preparation of antibodies highly specific to diacetylspermidine,and development of an ELISA system for its sensitive and specific detection." Journal of Biochemistry. 121. 1134-1138 (1997)
• [Publications] Shigemi Yoshioka: "Analysis of the distribution of Na^+/H^+ exchanger isoforms among the plasma membrane subfractions of bovine kidney cortex." Journal of Biochemistry. 122. 641-646 (1997)
• [Publications] Shigemi Yoshioka: "Expression of the human UDP-galactose transporter in the Golgi membranes of murine Had-1 cells that lack the endogenous transporter." Journal of Biochemistry. 122. 641-646 (1997)
• [Publications] Sun-Wada,G.-H.: "Functional expression of the human UDP-galactose transporter in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Journal of Biochemistry. 122. (印刷中)
• [Publications] Yutaka Orii: "Oxidation process of bovine heart ubiquinol-cytochrome c reductase as studied by stopped-flow rapid-scan spectrophotometry and simulations based on the mechanistic Q cycle model." Jouranal of Biological Chemistry. 272. 17594-17604 (1997)
• [Publications] Masafumi Tsugimoto: "Purification,cDNA cloning,and characterization of a new serpin with megakaryocyte mutation activity." Journal of Biological Chemistry. 272. 15373-15380 (1997)
• [Publications] 三木俊明: "タンパク質化学第4巻" 広川書店(野崎光洋,折井豊,指吸俊次編)(印刷中),