1997 Fiscal Year Annual Research Report
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08680790
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
若松 佑子 名古屋大学, 生物分子応答研究センター, 助教授 (20026800)
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| Keywords | メダカ / ES細胞 / 遺伝子導入 / GFP / ネオマイシン耐性 |
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| Research Abstract |
すでに樹立されていたES様細胞株OLES1に続き、OLES2を胞胚期胚盤葉細胞の培養によって樹立した。この細胞株を用いて、相同組換えによる遺伝子の導入法の開発を以下に1)〜4)述べる点について試みた。
1)細胞に遺伝子を導入するための実験条件を、エレクトロポレーションとリポフェクションについて調べた。エレクトロポレーションについては、メダカβ-アクチンプロモーターにGFP遺伝子をつないだDNA断片をマーカーとして電圧の条件を0〜450Vの範囲で変えて遺伝子導入の効率を調べた。その結果、電圧が高くなるにつれて、細胞の生存率は低下し、遺伝子の導入率は上昇することがわかった。電圧が最高の450Vでの生存率は12.8%、導入率は0.77%であった。
リポフェクションについてはリポフェクタミン40μlとDNA18μg/ml培養液で20時間処理の条件で遺伝子導入を行ったところ、0.5%の細胞がGFPを発現した。GFP発現細胞を単離して培養し、GFP発現クローンを得た。
2)相同組換え体の選別を行うために用いる選択薬剤G418とGANCに対する細胞の感受性を調べた。
G418の濃度が0〜600μg/mlの範囲で調べたところ、300μg/ml以上の濃度で感受性を示し、600μg/mlではすべての細胞が5日以内に死滅した。ネオマイシン耐性遺伝子DNAをエレクトロポレーションによって細胞に導入したところ、G418の濃度が600μg/mlでも耐性を示す細胞集団が得られた。また、フィーダー細胞にも遺伝子を導入し、ネオマイシン耐性フィーダー細胞株を樹立した。
GANCの細胞毒性を0〜0.5μMの範囲の濃度で調べたところ、0.1μMでは明らかな毒性は見られなかったが、0.2μM以上の濃度では濃度依存的に毒性が見られた。
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[Publications] G.Tamiya: "An embryological study of ventralization of dorsal structures in the tail fin of medaka(Oryzias latipes)Da mutants." Develop.Growth Differ.39. 531-538 (1997)
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[Publications] H.Hashimoto: "Effects of carp serum on the growth of goldfish fin cells in early passage." J.Fish Biol.50. 201-207 (1997)
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[Publications] M.Kinoshita: "A stable line of transgenic medaka(Oryzias latipes)carrying the CAT gene." Aqudculture. 143. 267-276 (1996)
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[Publications] H.Toyohara: "Transgenic expression of L-gulonoー ーlactone oxidase in medaka(Oryzias latipes),a teleost fish that lacks this enzyme necessary for l-ascorbic acid biosynthesis." Biophys.Biochem.Res.Commu.223. 650-653 (1996)
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[Publications] H.Toyohara: "Functional promoter activity of human heat-shock element in transgenic medaka fry." Ann.Report Interdispl.Res.Inst.Environ.Sci.15. 49-53 (1996)
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[Publications] 若松佑子: "魚類発生工学のストラテジー" 海洋. 30. 119-122 (1998)
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[Publications] 青木 宙: "魚類のDNA" 恒星社厚生閣, 467 (1997)
