アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質を用いた部位特異的遺伝子導入

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08770221
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 卜部 匡司 自治医科大学, 医学部, 助手 (40213516)
• Keywords: アデノ随伴ウイルス / Rep蛋白質 / 部位特異的遺伝子導入 / AAVS1領域

Research Abstract

アデノ随伴ウイルスのコンポーネントであるRep蛋白質とITR配列を利用しての第19番染色体AAVS1領域への部位特異的外来性遺伝子導入法を確立するため、4種類あるRep蛋白質(Rep78、68、52、40)のうちどれがAAVS1への特異的組込み活性を持つか調べた。個々のRepを単独で発現するプラスミドと、ITR配列で挟んだネオマイシン耐性遺伝子(Neo^r)発現ユニットを持つプラスミドを作製し、それらを同時に293細胞にトランスフェクトし、AAVS1領域へのNeo^rプラスミドの特異的組込みの有無をPCRを応用した検出法により検討した。その結果、Rep78、68がAAVS1への組込み活性を持つことを明らかにした。さらに、トランスフェクトした細胞をG418で選択を行い、コロニーを形成させ、個々のクローンをサザンブロット法、FISHにてNeo^rの19番染色体AAVS1領域への組込みの有無を解析した。コントロールとしてRepプラスミドの代わりにブランクベクターを用いた場合、10クローン解析したうち、AAVS1領域への組込みを示したクローンはなかったが、Rep78、68を用いた場合それぞれ4/10、1/8に部位特異的組込みが認められた。つまりRep78の方がRep68より、より部位特異的にNeo^rを組み込むことが判った。今後は、さらに部位特異的組込み効率を上げるため、過剰に発現させると細胞毒性を示すRep蛋白質の発現量を調節するシステムを導入し、より安全性の高い染色体DNAへの部位特異的組み込み法を確立したい。

Research Products

• [Publications] 卜部匡司: "遺伝子治療" 医薬ジャーナル社, 141 (1996)
• [Publications] 卜部匡司: "イラスト医学&サイエンスシリーズ遺伝子治療" 羊土社, 110 (1997)