骨芽細胞における24-水酸化酵素遺伝子のStable transfection

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08771658
• Research Institution: Ohu University
• Principal Investigator: 西勝 祥子 奥羽大学, 歯学部, 助手 (30170484)
• Keywords: 24-水酸化酵素 / クローニング / 1,25(OH)_2D_3 / COS-7 cell / Transfection / ビタミンD代謝 / シクロヘキシミド

Research Abstract

24-水酸化酵素は、活性型ビタミンDである1α,25-dihydroxyvitamin D_3[1,25(OH)_2D_3]の分解及び循環型ビタミンDである25-hydroxyvitamin D_3(25OHD_3)代謝の主要な酵素である。本酵素は腎や小腸で1,25(OH)_2D_3投与により強く誘導され、1991年にその遺伝子がクローニングされた。代表研究者は、マウス24-水酸化酵素のFull-length cDNAのクローニングに成功し、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド投与により、腎や小腸でそのmRNAが著しく上昇することを見出した(Endocrinology 1997 in press)。また、活性型ビタミンDアナログの22-oxacalcitriolが24-水素化酵素のmRNA及び活性を腎と小腸で増加させ、1,25(OH)_2D_3の分解を促進し、血中1,25(OH)_2D_3レベルを低下させることを見出した(Biochem.Pharmacol.48(11):2081-2090,1994)。
24-水酸化酵素を定常的に発現している細胞株を得るために、今回クローニングしたマウスのFull-length cDNAをLipofectinを用いてCOS-7細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしたCOS-7細胞からtotal RNAを抽出し、24-水酸化酵素mRNAの発現量をマウス24-水酸化酵素cDNAをプローブとしてNorthern blot法で検討した。その結果、このCOS-7細胞は非常に大量の24-水酸化酵素mRNAを発現していることが確認された。しかしながら、トランスフェクトしたCOS-7細胞における24-水酸化酵素の活性は検出されなかった。この理由は不明だが、水酸化酵素活性発現のために必須の電子伝達体としてのフェレドキシンやフェレドキシンリダクターゼの発現がCOS-7細胞中で不十分であることが考えられる。今後、24-水酸化酵素、フェレドキシン、フェレドキシンリダクターゼの3種のcDNAを同時に細胞にトランスフェクトし、定常的に24-水酸化酵素遺伝子及びその酵素活性を発現している細胞株の確立をめざしたい。

Research Products

• [Publications] Nagako Akeno: "Mouse vitamin D-24-Hydroxylase : Molecular Cloning,Tissue Distribution,and Transcriptional Regulation by 1α,25-Dihydroxyvitamin D_3" Endocrinology. (in Press). (1997)
• [Publications] Noboru Horiuchi: "Synthesis of 25-hydroxyvitamin D_3-26,23-lactone but not 24,25-dihydroxyvitamin D_3 from 25-hydroxyvitamin D_3 in opossum kidney cells treated with 1α,25-dihydroxyvitamin D_3" Hormone and Metabolic Research. 27. 83-89 (1995)
• [Publications] Nagako Akeno: "Induction of vitamin D 24-hydroxylase messenger RNA and activity by 22-oxacalcitriol in mouse kidney and duodenum : Possible role in decrease of plasma 1α,25-dihydroxyvitamin D_3" Bioch mical Pharmacology. 48. 2081-2090 (1994)