1996 Fiscal Year Annual Research Report
大腸菌の挿入因子IS1及びIS3の転移とその調節機構に関する研究
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08780647
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
関根 靖彦 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助手 (80222074)
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| Keywords | トランスポゾン / 挿入因子(IS) / トランスポゼ-ス / 転移反応 / DNA結合タンパク質 / 環状分子 |
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| Research Abstract |
1.IS1がコードするInsAタンパク質、トランスポゼ-スの精製及びその性質の生化学的解析
InsAタンパク質及びトランスポゼ-スを、ポリヒスチジンタグとの融合タンパク質の形で過剰生産し、精製することに成功した。次に、これらのタンパク質のIS1の末端逆向き配列(IR)に対する結合活性をゲルシフト法で調べたことろ、両タンパク質ともIR特異的DNA結合活性を持つことがわかった。また、IS1を運ぶプラスミドを保持する大腸菌内でトランスポゼ-スの作用によりIS1が環状分子として切り出されることを発見した。この分子はIS1の転移反応の重要な中間産物であり、その生成機構を研究することはIS1の転移機構を理解する上での大きな足がかりになると考えている。
2.IS3の転移頻度測定系の構築、及びIS3がコードするタンパク質の機能の解析
研究実施計画に記した通りの転移頻度測定系を構築し、実際にIS3が標的プラスミドに、標的部位の3塩基対を重複する形で単純挿入していることを明らかにした。OrfA、OrfBタンパク質を誘導産生するプラスミドをこのアッセイ系に導入したところ、OrfAタンパク質は転移頻度を低下させること、OrfBタンパク質はOrfAタンパク質による転移阻害作用を増強する活性をもつことがわかった。
3.IS3がコードするトランスポゼ-スの精製及びその性質の生化学的解析
IS3のトランポゼ-スをポリヒスチジンのタグとの融合タンパク質の形で産生できるプラスミドを構築した。タグが付加した状態でもトランスポゼ-スは生体内で転移をひきおこす活性をもつことを確認した。このプラスミドを用いてIS3のトランスポゼ-スを大量産生、精製し、得られたトランスポゼ-スを用いて、IS3の転移反応のin vitroでの再現を目指す予定である。
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[Publications] Sekine,Y.: "Isolation and characterization of IS1 circles." Gene. (in press). (1997)
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[Publications] Sekine,Y.: "Identification and characterization of the linear IS3 molecules generated by staggered breaks." J.Biol.Chem.271. 197-202 (1996)
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[Publications] Ohtsubo,E.: "Bacterial insertion sequences." Current topics in Micribiology and Immunology.204. 1-26 (1996)
