1996 Fiscal Year Annual Research Report
pH-sensitive tyrosine kinaseのクローニング
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08877178
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
池田 雅人 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (00222901)
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| Keywords | tyrosine kinase / Cloning / pH |
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| Research Abstract |
生体はpHに反応し、細胞単位で様々な代謝の変化が誘導される。腎集合管は最終尿pHを規定する分節として重要である。最近、我々はアルカリにより転写亢進する腎集合管のタンパクについて報告した。この転写亢進はチロシンキナーゼ阻害薬により消失することから、腎集合管主細胞には、チロシンキナーゼドメインを内在するH+感受性レセプターが存在すると考え、クローニングに着手している。以下に現在までの研究概要を記す。
1.細胞培養:SV40で形質転換した3-6世代の兎腎集合管主細胞の培養細胞を用いた。細胞の分化を促進するため、collagenn coated dishes上でconfluentまで培養した後、quiesent medium(無血清)で24時間培養した。その後、培養液のpHを8.0とし、24時間さらに培養を続けた。
2.mRNA抽出、RT-PCR:細胞から経時的にpoly(A)^+mRNAを抽出する。チロシンキナーゼドメインの保存領域に対応するdegenerative primerを作成し、得られたpoly(A)^+mRNAからRT-PCRを行った。期待される約200bpのPCR productをPCRTMII vector(Invitrogen)に導入し、ジデオキシ法により塩基配列を決定した。
3.塩基配列からprotein kinase domainをもつ新しい1クローンを選定し、ノザンブロットより腎臓と脳幹に強く発現することを確認した。現在、RACE法によりfull-length cDNAを得ようとしている。
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