ラット大脳皮質初代培養上清中のアポトーシス抑制因子により誘発される遺伝子群の解析

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08877351
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 植田 弘師 長崎大学, 薬学部, 教授 (00145674)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福嶋 伸之 横浜市立大学, 医学部, 助手 (10254161)
• Keywords: ラット大脳皮質初代培養 / アポトーシス抑制因子 / プロテインキナーゼC / Differential Display法 / ヘルペスウイルス / bcl-2

Research Abstract

ラット大脳皮質細胞を低密度で初代培養を行なうと、アポトーシスにより細胞死が起る。この細胞死は、高密度由来の培養上清の添加することにより、あるいは高密度で培養することにより抑制される。今回の研究において、1)培養上清中のアポトーシス抑制因子(AIF)の情報伝達および2)高密度特異的に発現する遺伝子群の解析を行なった。
1)培養上清からAIF-20およびAIF-22を部分精製し、その情報伝達を薬理学的に解析したところ、フォスフォリパーゼC-プロテインキナーゼCの経路を介して作用することが明らかになった。さらに、両AIFは大脳皮質および中脳の神経細胞に対して生存効果を示したが、後根神経節およびPC12細胞の生存に対して影響を及ぼさなかった。これらの知見は、AIF-20およびAIF-22が新規の生存因子である可能性を示唆している。
2)高密度培養下で認められる生存促進効果は、アクチノマイシンDあるいはシクロヘキシミドにより抑制された。AIFによる生存効果も同様にこれらの薬物により低下した。生存に関わる遺伝子群を解析するために、高密度および低密度培養由来のRNAを用いてDifferential Display法を行い、最終的に8個のクローンを単離した。このうち、新規遺伝子であるクローン4-4の発現を培養下において経時的に見たとき、低密度により発現が低下すること、この低下が高密度あるいはAIFにより抑制されることが分かった。これらの時間経過は細胞死のそれとよく一致していた。クローン4-4のセンスおよびアンチセンスのDNAをコードする欠損型ヘルペスウイルスを作成し初代培養系に感染させたところ、アンチセンスにより細胞死抑制分子のbcl-2遺伝子の発現が低下することが認められた。これらの結果は、クローン4-4がbcl-2の発現を介して神経細胞の生存に関与していることを示唆している。