ESTクローンを用いたアラビドプシスの天然物生合成系のリバースジェネティクス

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08878082
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 斉藤 和季 千葉大学, 薬学部, 教授 (00146705)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野路 征昭 千葉大学, 薬学部, 助手 (80271534) ; 山崎 真巳 千葉大学, 薬学部, 講師 (70222370)
• Keywords: ESTクローン / シロイヌナズナ / 硫酸イオントランスポーター / cDNA / システイン生合成

Research Abstract

【目的】アントシアニン生合成において、ロイコアントシアニジンからのアントシアニジンの生成反応はアントシアニジン合成酵素(ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ)(LDOX)により触媒されることが分子遺伝学的に示唆されている。しかし、本酵素の活性をin vitroで検出した例はなく、酸化酵素の他に脱水酵素の存在の可能性等、反応の詳細は明らかとされていない。そこで本研究ではアカジソ葉で特異的に発現するLDOXのcDNAを大腸菌で高発現させて得た組み換え精製タンパク質について、in vitroでの酵素化学的解析を行った。
【実験・結果】1.LDOXの発現とアントシアニン含有量の解析LDOOXのNorthern解析並びにWestern解析を行ったところ、LDOXのmRNAとタンパク質はアカジソの葉と茎に特異的に発現していることが示され、これらの発現パターンは各組織のアントシアニン含有パターンに一致した。
2.精製タンパク質の酵素化学的解析LDOX cDNAのORF領域を大腸菌高発現ベクターに導入し高発現系を構築した。その結果、発現誘導後の大腸菌抽出液にLDOX活性が確認された。この反応系より二価鉄イオン、アスコルビン酸、または2-オキソグルタル酸を除いた系ではLDOX活性の顕著な減少がみられ、LDOXが2-オキソグルタル酸依存性酸化酵素であることが生化学的に証明された。本組み換えタンパク質を精製し解析を行った結果、精製タンパク質においてもLDOX活性が確認された。このことから、ロイコアントシアニジンからのアントシアニジンの生成には本酵素だけで必要十分であり、特異的な脱水酵素はなくても反応の進行することが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Kazuki Saito, et.al.,: "Molecular cloning,characterization and expression of cDNA enooding phosphoserine aminotransferase involved phosphorylated pathway of serine biosynthesis from spinach." Plant Mol.Biol.33. 359-366 (1997)