分裂酵母を用いた、細胞機能の系統的解析システムの開発研究

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08878131
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 藤山 秋佐夫 国立遺伝学研究所, 総合遺伝研究系, 助教授 (60142311)
• Keywords: 分裂酵母 / 突然変異 / DNAライブラリー / 発現ベクター / cDNA

Research Abstract

平成8年度研究実施結果
当初計画に従い、平成8年度においては下記の研究を実施した。主として本格研究のための準備が主な目的である。
1.分裂酵母突然変異体ライブラリの構築。本研究では、分裂酵母の異なる接合型の各々に対してsaturation mutagenesisを行い、生じた突然変異体の集団を突然変異体ライブラリとする。それらに対してさまざなDNAライブラリーを導入し、実際に起きた変異と細胞機能との関連を追求する計画である。そのためにまず、平均1遺伝子、すなわち数kbのインサート長を持ち、重複度の高いライブラリを効率よくスクリーニングするシステムを構築した。現在、平均多重度が5、メンバー数が約15,000のライブラリをアレイ化しており、高密度メンブレン4枚を用いて効率よく分裂酵母全遺伝子のスクリーニングを行うことが可能になった。
2.1.で作成したライブラリには、rRNAなど大量に発現される遺伝子から極微量にしか発現されないもの。また、構成的に発現される遺伝子や条件依存的に発現される遺伝子をコードするクローンが含まれる。今年度の研究では、上記ライブラリーを構成的発現レベルの違いに着目して系統的に分離し、発現レベル別のライブラリを構築した。このようなライブラリを準備することにより、ディファレンシャルに発現される全遺伝子をスクリーニングすることが可能になった。モデル実験として、細胞内情報伝達に関与するrasl遺伝子に依存的に発現される遺伝子群のスクリーニングを行った。結果については、解析が進行中である。
cDNA発現ベクター系の開発。以下の条件を満たすベクターのデザインを行い、構築を開始した。条件依存的に誘導もしくは抑制が確実に行える分裂酵母のプロモーターを持つこと。cDNAライブラリ構築のため、ベクタープライマーの機能を持たせること。自律増殖能を持つことである。