新しい世代間負荷実験系の確立とトリプレットリピート伸長病への応用

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08878161
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 笠井 憲雪 東北大学, 医学部, 教授 (60001947)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三好 一郎 東北大学, 医学部, 助手 (10183972)
• Keywords: 遺伝子導入法 / 動物実験法 / 世代間負荷実験 / トリプレットリピート伸長病

Research Abstract

世代を経るとゲノム内の3塩基反復配列が伸長することが原因であるヒトトリプレットリピート伸長病では、機構は不明だが、精子形成時にトリプレットリピートが不安定となって伸長すると考えられている。世代交代に伴う様々な遺伝的変化(世代間負荷)の研究に実験動物を使用することが実験期間の短縮(加速化)に有用であるが、この疾病の場合、精子レベルでの実験を実現すれば更に加速化・使用動物の数の削減可能である。まず、トリプレットリピート伸長病の遺伝子とその周辺領域の遺伝子を、精巣内の精子形成期の細胞(精母細胞から精子細胞等)に効率良くinvivo導入する方法を検討する。更に、精子中の導入遺伝子内のトリプレットリピートの伸長を調べることで、その伸長に必要な領域遺伝子が同定できるか検討し、導入遺伝子の不安定性を検出するための新たな世代間負荷動物実験系の確立を目的として本研究を行っている。
平成8年度には、まず、導入遺伝子をマウスの精巣に直接注入する際の条件ーリポソームの組成とDNA量、注入量、回数、時期等を検討した。1,2-dimyristyloxypropy1-3-dimethyl-hydroxyl ethyl ammonium bromideとcholesterol(1:1)からなるリポソームと導入遺伝子を1:1に混合し、250ng/lの濃度で20lずつマイクロシリンジを用いて4日間隔で精巣に注入した場合、精巣上体尾部の精子中に導入遺伝子が十分検出されることがわかった。精巣上体尾部から回収した精子をプラスチックシリンジと三方活栓を用いて洗浄後、抽出したDNAを用いてPCR法にて導入遺伝子が容易に検出された。また、少量の精液を直接テンプレートに用いることができるか検討中である。平成9年度には、この方法を用いて、長さを変えたトリプレットリピートをもつ様々な導入遺伝子をトランスフェクトし、トリプレットリピート伸長に必要な領域遺伝子を検索する。また、同時に導入された遺伝子が精子の遺伝子に組み込まれているか調べ、トリプレットリピート伸長との関係を検討する予定である。

Research Products

• [Publications] Okabe M.: "Direct visualization of copper-metallothionein in LEC rat kidneys: application of autofluorescence signal of copper-thiolate cluster." Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 44・8. 865-873 (1996)
• [Publications] Nakayama K.: "Visualization of yellowish-orangeluminescence from cuprous metallothioneins in liver of Long-Evans Cinnamon rat" Biochimica et Biophysica Acta. 1289・1. 150-158 (1996)
• [Publications] Miyoshi, I.: "A solid phase enzyme-linked assayfor ceramide glycanase using GMl and a novel-galactosidase inhibitor" Analytical Biochemistry. 236. 360-363 (1996)
• [Publications] Yamashita, T.: "The effects of-phenyl-tetra-butyl nitrone(PBN)on copper-induced rat fulminant hepatitis with jaundice" Free Radical Biology & Medicine. 21・6. 755-761 (1996)