遺伝子組み替え中間体Holliday Junction のNMRによる構造解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09044098
• Research Institution: TOKYO METOROPOLITAN UNIVERSITY
• Principal Investigator: 小野 晶 東京都立大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (10183253)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三宅 洋子 東京都立大学, 大学院・理学研究科, 助手 (40244412) ; 楯 真一 北陸先端科学技術大学院大学, 新素材センター, 助教授 (20216998)
• Keywords: 多核種多次元NMR / 安定同位体標識 / DNAの化学合成 / Holliday Junction

Research Abstract

1、^<13>C-標識グルコースを出発原料として、糖部が位置・立体選択的に^<13>C/^2Hで多重標識されたヌクレオシド類の化合合成ルートの開発研究を行った。グルコースを化学変換して得られる5-オキソペントースの5位ホルミル基を重水素化試薬を用いて還元することによりリリボース5位に立体選択的に重水素を導入する反応を検討し、任意のジアセテレオマー比で重水素を導入する手法を開発した。この反応を利用して位置・立体選択的^<13>C/^2H-ヌクレオシド類の合成ルートを確立した。
2、化学合成的手法を用いて標識ヌクレオシドの5'-水酸基をリン酸化してdNMPとする反応の反応条件を検討した。2'-デオキシヌクレオシドのリン酸化はリボヌクレオシドのリン酸化に比較して反応の進行が悪く、収率が低いことが分かったが、塩基としてプロトンスポンジを用いたところ収率が改善された。
3、標識dNMPを化学反応または酵素反応を利用してdNTPとするルートを検討した。
4、エキソヌクレアーゼ活性を失活させたDNAポリメラーゼ変異体を用いて標識dNTPから標識DNAオリゴマーを調製する反応の反応条件を検討した結果、収率の向上を見た。当初はYale大学において開発された高発現系を用いて調製された酵素を用いて反応を行っていたが、品質の良い変異酵素が市販されるようになったため、市販の酵素で反応を行った。
5、標識DNAを用いた研究において、DNA塩基対における水素結合を通して窒素原子間にJ(結合定数)が観測されることを発見した。この現象を利用することにより塩基対の位置を正確に決定する手法を開発することが可能であるが、これはHJの様な高分子量複合体の構造解析に有用であることが期待される。
6、HJ構造を認識し、HJ部位でDNAを切断する酵素RuvC(大腸菌由来)とHJの複合体の構造を解析する目的で、RuvC変異体の高発現系を入手し、酵素の精製を試みた。RuvCの溶解性が悪いため構造解析には至らなかった。

Research Products

• [Publications] Fernandez, C.: "Conformational changes of the BS2 operator DNA upon complex formation with the Antennapedia Homeodomain studied by NMR with ^<12>C/^<15>N-labeled DNA."Journal of Molecular Biology. 292. 609-617 (1999)
• [Publications] Szyperski, T: "The 2D (^<31>P) spin-echo-difference constant-time [^<13>C,^1H]-HMQC experiment for simultaneous determination of JH3'P and JC4'P in 13C-labeled nucleic acids and their protein comlexes."Journal of Magnetic Resonance. 140. 491-494 (1999)
• [Publications] Kojima, C: "Quantitative measurement of transverse and longtiudinal cross-correlation between ^<13>C-^1H dipolar interaction and ^<13>C chemical shift anisotropy : application to a ^<13>C-labeled DNA duplex."Journal of Magnetic Resonance. 136. 169-175 (1999)
• [Publications] Kojima, C: "DNA duplex dynamics : NMR relaxation studies of a decamer with uniformly ^<13>C-labeled purine nucleosides"Journal of Magnetic Resonance. 135. 310-333 (1998)
• [Publications] Pervushin, K: "NMR scalar couplings across Watson-Crick base pair hydrogen bonds in DNA observed by TROSY"Proc Natl. Acad. Sci. USA. 95. 14147-14151 (1998)
• [Publications] Oogo, Y: "Synthesis of [5'-^2_1]-nucleosides with defined (5'S)/(5'R)-ratios."Tetrahedron Letters. 39. 2873-2876 (1998)