新規抗体の無細胞生合成系の構築 Cell-free biosynthesis system of novel antibodies

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09044119
• Research Institution: TOHOKU UNIVERSITY
• Principal Investigator: 熊谷 泉 東北大学, 大学院・工学研究科, 教授 (10161689)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): VOLKER Erdma ベルリン自由大学, 生物化学研究所, 教授
• Keywords: 抗体 / 無細胞生合成系 / 分子認識 / 遺伝子工学 / 高原特異性 / 蛋白質工学 / 進化工学

Research Abstract

抗体は、構成するドメイン構造を遺伝子レベルで入れ替えることにより、膨大な数の抗原に対する特異的な分子認識を達成している。この特異的な分子認識能を利用し、医薬品や臨床検査薬等に広く利用され、工学的にもバイオセンサーなどへの応用が期待されてきた。近年、抗体可変領域を、微生物を用いた発現系により作製する系の構築が報告されつつあるが、分子種によって顕著な発現量の差異が見られ、汎用性の高い発現系の構築が望まれていた。本研究は、新規抗体の自在な作製系の構築と、その進化工学的手法への応用を目標とした。前年度における抗ニワトリリゾチーム抗体HyHEL10-本鎖抗体(scFv)の大腸菌無細胞生合成系の確立を基に、以下の二つの研究を遂行した。(1)リボソーム構成蛋白質S7との融合発現と応用:S7-scFv(SH)とscFv-S7(HS)の二つの順序で融合蛋白質を設計し、前年度確立した生合成系により発現を試みたところ、HSはその発現産物のほとんどが不溶性分子となるのに対して、SHはシャペロンを加えなくとも一部が可溶性分子として得られることが分かり、リボソームへの提示系を含めた進化工学への容易な応用が可能となった。(2)医学的に重要な抗体について、抗MUC1抗体MUSE11、抗D抗原特異的抗体について、その一本鎖抗体の合成系の確立を試み、前年度作製した発現系の汎用性を確認し、抗体分子の汎用性ある調製を可能にした。

Research Products

• [Publications] Tsumoto et al.: "Novel selection method for engineered antibodies using the mechanism of Fv fragment stabilization in the presense of antigen" Protein Engineering. 10. 1311-1318 (1997)
• [Publications] Furuta et al.: "Construction of mono- and bi-valent human single-chain Fv fragments aginst the O-antigen in the Rh blood group" Protein Engineering. 11. 233-241 (1998)
• [Publications] Tsumoto et al.: "Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragment from inclusion bodies overexpressed in E coli by controlled ・・・・・・" Journal of Immunological Methods. 219. 119-12〓 (1998)
• [Publications] Koshiba et al.: "Thermal study of mutant human lysozymes with partially introduced Ca binding sites by using efficient refolding system" Protein Engineering. 11. 583-590 (1998)
• [Publications] Chaudhuri et al.: "Effect of the extra N-terminal methionine vesidue on the stability and folding of recombinant α-lactalabumin in E,Coli" Journal of Molecular Biology. 285. 1179-1199 (1999)
• [Publications] Merk et al.: "Cell-free expression of two single-chain monoclonal antibodies against lysozyme" Journal of Biochemistry. 125. 328-331 (1999)
• [Publications] 前仲ら: "Structural analysis of mutant hen egg-white lysozyme prefering a minor binding mode" Biochim.Biophys.Acta. 1384. 23-31 (1998)
• [Publications] Kitamura et al.: "Cloning and expression of the gene encoding flavodorin from Desulfovibrio valgan's (Miyazaki F)" Journal of Biochemistry. 123. 891-898 (1998)
• [Publications] Maenaka et al.: "Disclosure of another carbohydrate binding site in hen egg-white lysozyme by conversion of subsite B structure" Biochemical Journal. 331. 71-76 (1998)
• [Publications] Hori et al.: "Substrate Recognition of tRNA(Guanosine-2'-)-methyltransferase from Thermus thermophilus HB27" Journal of Biological Chemistry. 273. 25721-25727 (1998)
• [Publications] Tanaka et al.: "PI-Specificity of Agualysin I(a Subtilisin-type Serine Protease)from Thermus aquatiocus YT-C using PI-Substituted Derivatives of SSI" Biosci.Biotechnol.Biochem.62. 2035-2038 (1998)
• [Publications] Sakurai et al.: "SEA-scFv as bifunctional antibody." Biochemical Biophysical Research Communication. (印刷中). (1999)
• [Publications] Suzuki et al.: "Open sandwich ELISA with VH-/VL-alkaline phosphatase fusion proteins" Journal of Immunological Methods. (印刷中). (1999)
• [Publications] Kitamura et al.: "Expression of a Model Peptide of a Marine Mussel Adhesive Protein in Ecoli." Journal of Polymer Science,A,Polymer Chemistry. (印刷中). (1999)
• [Publications] 熊谷、津本: "生体外選択系による新機能抗体分子の創製" 蛋白質 核酸 酵素. 43. 159-167 (1998)
• [Publications] 熊谷、津本、前仲: "ファージ提示系による抗体工学" 日本生物物理学会誌. 213. 1219-222 (1997)
• [Publications] 上田ら: "新たな免疫測定法" 遺伝子医学. 3. 170-175 (1999)
• [Publications] 熊谷、津本、前仲: "構造生物学(共著)" 朝倉出版, 13 (1998)
• [Publications] 熊谷、津本: "遺伝子工学(分子遺伝学 共著)" 丸善出版社, 25 (1997)
• [Publications] 三沢、熊谷: "医薬品開発を目指したプロテインエンジニアリングの現状(共著)" CMC出版, 8 (1998)
• [Publications] 熊谷、津本: "抗体工学(天然高分子研究の新展開、共著)" CMC出版, 12 (1998)