1999 Fiscal Year Annual Research Report
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09044230
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| Research Institution | KYUSHU UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
下東 康幸 九州大学, 大学院・理学研究科, 教授 (00211293)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤田 亜美 九州大学, 大学院・理学研究科, 学振特別研究員
中馬 吉郎 九州大学, 大学院・理学研究科, 学振特別研究員
野瀬 健 九州大学, 大学院・理学研究科, 助手 (10301334)
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| Keywords | 受容体 / 鎮痛ペプチド / オピオイド受容体 / エンケファリン / 内蔵リガンド / 受容体活性化 |
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| Research Abstract |
オピオイド受容体を初めとする7回膜貫通型受容体の構造が相次いで解明され、リガンド結合部位を特定する研究が実施されるようになってきたものの、リガンドの結合したのちの受容体分子の情報伝達機構の解析については有効な研究手法がなく、手着かずの状態が続いている。本研究は、「オピオイド受容体にリガンド・エンケファリンを内蔵させ」、内蔵リガンドと外部リガンドを組合せ使用により受容体分子機構を解明するというユニークな発想に基づく。当初はエンドルフィンN端8残基(N末端5残基はエンケファリンの配列に相当)を挿入したδ型とμ型の変異受容体をCHO細胞に発現して調べたが、外部リガンドの活性化は受けたものの、酵素・トロンビンでは完全な活性化には至らなかった。次いで、細胞膜外N末端領域を基本的にトロンビン受容体のものを用いることにし、これのリガンド部位にエンケファリン(5残基)を挿入したδ型オピオイドキメラ体(PADOR)を作製、COS細胞で発現させた。PADORのN末端部にはタンパク質標識M1エピトープを組込んだが、これを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング法により陽性となり、受容体の細胞膜への発現が確認された。このPADORは、通常のδ型受容体と同様にアゴニストが結合し、受容体は活性化された。酵素・トロンビンによるPADORの処理すると、N末端部は切断され、エンケファリンが露出されることになるが、このことをN端遊離のエンケファリン配列のみを認識する抗体(3E-7)によるウエスタンブロッティング法により確認した。しかしながら、内蔵エンケファリンの露出による受容体活性化は非常に小さく、必ずしも十分とは言えなかった。本研究により「受容体にそのリガンドを内蔵させる」方法論が確立され、受容体分子機構解析の新規な分子ツールの開発に成就した。
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[Publications] Yoshiro Chuman: "Analysis of peceptor Activation Mechanism by Incorpatating the Ligand Peptide into the Receptor:A Delta Opioid Receptor Tehering Enkephalin,"Peptide Scince 1999. (印刷中、現在発行予定). (2000)
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[Publications] Tsugumi Fujita: "Highly Potent Peptide Ligands for Thrombin Receptor"Peptide Science 1999. (印刷中、現在発行予定). (2000)
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[Publications] Tsugumi Fujita: "The Design and Syntheses of para-Fluorophenylalanine Amide Derivatives as Thrombin Receptor,"J,Biochem,. 126(1). 174-179 (1999)
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[Publications] Naoto Shirasu: "Expolartion of Universal Cysteines in the Binding Sites of Three Opioid Receptor Subtypes by Cisufide-Bonding Affinity Labeling with Chemically Activated Thiol-Containing Dynorphin A Analogs"J,Biochem,. 126(1). 254-259 (1999)
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[Publications] Yasuyuki Shimohigashi: "Design of Serine Protease Inhibitors with Conformation Restricted by Amino Acid Side-Chain-Side-Chain CH/π Interaction,"Biopolymers(Peptide Science). 51. 9-17 (1999)
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[Publications] Kazushi Okada: "Effects of Substitution of Hydrophobic Amino Acids by Tryptophan on Receptor Binding and Biological Activity of Neuropeptides Nociceptin"Bull,Chem,Soc.Jpn.. 72. 1899-1904 (1999)
