部位特異的変異法によるNO合成酵素の電子移動機構と酸素分子活性化機構の解明

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09235201
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 清水 透 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (40118956)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): ダフ サイモン 東北大学, 反応化学研究所, 助手 (50292298) ; 佐藤 秀明 東北大学, 反応化学研究所, 助手 (60271996) ; 佐上 郁子 東北大学, 反応化学研究所, 講師 (10143033) ; 伊藤 攻 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (30006332)
• Keywords: NOの合成と反応 / シトクロムP450とNOとの反応 / キラル識別 / ヘムとCOとの結合 / フラッシュホトリシス / アルギニン / ダイナミックス

Research Abstract

1.肝臓中に存在し薬物代謝に関与しており、又肝臓内における存在量が最も多いとされるシトクロムP450がアルギニンからNOと合成することができるかを調べた。その結果、活性はNO合成酵素よりは低いながら中間体である水酸化アルギニンからかなりの量のNOが合成されることが明らかになった。
2.分解してNOを放出することができるアンジェリ塩とシトクロムP450との相互作用を調べた。その結果、アンジェリ塩の分解をP450は促進し、又放出されたNOはシトクロムP450の酸化一還元、スピン状態 さらには 配位構造まで変化させることが明らかになった。
3.NO合成酵素の構造と機能の関係を調べる目的でラット脳由来NO合成酵素をパン酵母に大量に合成させる系を確率した。
4.NO合成酵素の活性部位はシトクロムP450と同じヘム鉄である。シトクロムP450の構造とアミノ酸配列からNO合成酵素の酸素活性化に重要であると推定されるアミノ酸を部位特異的変異を用いて明らかにした。
電子吸収スペクトルを用いてNO合成酵素の活性部位周辺のキラル識別についての有用な知見を得た。
迅速光解離法を用いてNO合成酵素のヘム活性部位へのCO結合速度を調べ、各種反応阻害剤が酸素分子導入経路に結合する可能性を示唆した。

Research Products

• [Publications] H.Sano, H.Sato, I.Sagami, T.Shimizu: "Nitric Oxide Synthase Capabilities of Cytochrome P450 lA2 and NADPH-Cytochrome P450 Reductase from NG-Hydroxy-L-Arginine" Chemistry Letters. 759-760 (1997)
• [Publications] Y.Shibata, H.Sato, I.Sagami, T.Shimizu: "Interaction of Angelis Salt with Cytochrome P450 lA2 Distal Mutants : An Optical Absorption Spectral Study" Biochimica et Biophysica Acta. 1345. 67-75 (1997)
• [Publications] I.Sagami, T.Shimizu: "The Crucial Roles of Asp314 and Thr315 in the Catalytic Activation of Molecular Oxygen by Neuronal Nitric-oxide Synthase" Journal of Biological Chemistry. 273. 2105-2108 (1998)
• [Publications] Y.Shibata, H.Sato, I.Sagami, T.Shimizu: "The N=N Bond Cleavage of Angeli's Salt Is Markedly Enhanced by Cytochrome P450 lA2 : Effects of Distal Amino Acid Mutations" Oxygen Homeostasis and Its Dynamics Book. 209-213 (1998)
• [Publications] I.Sagami, K.Nakano, S.Nomura, H.Sato, T.Shimizu: "Expression of Neuronal Nitric Oxide Synthase in Yeast : Purification and Characterization" The Biology of Nitric Oxide Book. 6(in press). (1998)