1997 Fiscal Year Annual Research Report
金属イオン-非イオン界面活性剤によるRNAの位置特異的切断反応
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09235229
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| Research Institution | Chiba Institute of Technology |
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Principal Investigator |
高久 洋 千葉工業大学, 工学部, 教授 (50101267)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高井 和幸 千葉工業大学, 工学部, 講師 (40260848)
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| Keywords | マグネシウムイオン / 非イオン界面活性剤 / スプライシング / イントロン / エキソン |
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| Research Abstract |
pre-tRNAの自己切断活性が見い出され、pre-tRNAのイントロン切除が起こっていることが明らかにされている。特にイントロンをもつArabidopsis tRNA^<Tyr>では非イオン界面活性剤の系でもスプライシングエンドヌクレース依存性切断が起こると考えられることから、RNA酵素とともに生命の進化に大きな関係があるものと考え、これら切断反応の作用機序を詳細にすることも目的とする。イントロンを含むpre-tRNA^<Tyr>に対するイントロン切除を確認するために、まずモデル反応としてピリミジン-A間で切断が起こるようなRNA13mer(GUUUCGUACAAAC)を用いてスプライシング反応に必須であるMg^<++>の存在下、切断反応に要求される最適条件を検討した。そしてMg^<++>濃度、5μM、pH7.8、反応温度37℃の条件下で最高の切断活性を示した。そこで実際にArabidopsis thaliana tRNA^<Tyr>をT7転写により構築し、上記で述べた条件下でイントロンの切除を試みたところ、主にtRNA^<Tyr>のU_<49>-A_<50>、U_<38>-A_<39>間で切断が起り、5'-_<39>AGACGCAGAUU_<49>-3'のイントロン部位が切除されることがわかった。しかし、スプライシング反応にはMg^<++>が必須であることから、Mg^<++>の存在下で反応を進行させているために、逆にtRNA^<Tyr>の構造を安定化させ、切断活性が低下するといった結果が得られた。この切断反応をMg^<++>のかわりにNH_4^+の存在下で行った場合にはその切断活性も向上した。特にtRNA^<Phe>の結晶構造中には4個のMg^<++>が配位し、その安定性に寄与していることからも、Mg^<++>が切断活性に強く影響を与えているものと思われる。
現在Mg^<++>-Briji58の濃度を変化させることでその切断活性の向上にもつとめている。また、通常スプライシング反応は低温で進行しやすいとの説もあり、この点についても検討中である。しかし、Mg^<++>-非イオン界面活性剤の系でtRNA^<Tyr>のイントロン切除が起こるといった事実は初めての例となる。
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[Publications] Kaoru Ushijima: "Site specific cleavage of tRNA by imidazole and/or primary amine groups bound at the 5'-end of oligodeoxyribonucleotides." Biochim.Biophys.Acta. (in press).
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[Publications] Kazumi Hosono: "Cleavage effect of oligonucleotides substituted at the cleavage sites with modified pyrimidine-and purine-nucleosides." Biochim.Biophys.Acta. 1354. 211-218 (1997)
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[Publications] Insil Kim: "NMR analysis of the hydrogen bonding interactions of the RNA-binding domains of the Drosophila Sex-lethal protein with target RNA fragments with site-specific [3-^<15>N] uridine substitutions." Nucleic Acids Res.25. 1565-1569 (1997)
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[Publications] Hidefumi Yamakawa: "Anti-influenza virus activities of nicked and circular dumbbell RNA/DNA chimeric oligonucleotides" Nucleosi es and Nucleotides. 16. 1713-1316 (1997)
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[Publications] Hiromi Shirakura: "Study on site specific cleavage of RNA" Nucleic Acids Res.Symp.Ser.37. 217-218 (1997)
