NMRとX線によるクロコウジカビ酸性プロテアーゼAの折れたたみ機構の解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09261205
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 田之倉 優 東京大学, 生物生産工学研究センター, 教授 (60136786)
• Keywords: 酸性プロテアーゼA / NMR / X線結晶構造解析

Research Abstract

クロコウジカビAspergillus niger var.macrosporusが分泌する酸性プロテアーゼAは基質特異性、阻害剤に対する反応性、一次構造、分子量等の性状が、従来のペプシン型酵素とは著しく異なる新規の酸性プロテアーゼである。本研究では、プロテアーゼAの立体構造、変性中間状態ならびに中性変性過程の解析を行ない、プロテアーゼAの折れたたみ機構を明らかにすることを目指してX線結晶構造解析とX線小角散乱測定を行った。
本酵素が活性を示すpH1.5〜3で得られた結晶についてX線回折を測定したところ、1.4Åの分解能の反射が得られた。重原子誘導体の探索を行った結果、Hgおよび2種類のPtの同型置換体が得られた。電子密度図から、この分子はクロワッサン型をしており、αヘリックスを含まずβシートのみからなることが分かった。アスパラギン酸プロテアーゼも主としてβシートからなるクロワッサン型をしており、プロテアーゼAは分子量がアスパラギン酸プロテアーゼに比べて約半分であるにもかかわらず、分子の外形はアスパラギン酸プロテアーゼと大雑把には相似形といえる。ただ、βシート構造の分子全体に対する配向が両者で明らかに異なっており、プロテアーゼAの立体構造は新規の3次元構造だった。また、酸性から弱アルカリ性の種々のpHでX線小角散乱の測定を行った。その結果、GuinierプロットからpHが高くなるに従って慣性半径Rgが増大することが示された。またKratkyプロットから、(1)pH4.5ではfolded structure、pH6.75や7.0ではunfolded structureであること、(2)pH6.2では完全なfolded stateでもunfolded stateでもない中間的な状態であること、が分かった。pH4.5からpH8.0への遷移速度をX線小角散乱測定したところ、時定数0.5秒の遷移が見られた。

Research Products

• [Publications] Sato,K.ラ: "Crystallization and preliminary crystallographic studies of dimethy1 sulfoxide reductase from Rhodobacter sphaeroides f.sp.Denitrificans." Proc.Japan Acad.73B・2. 30-32 (1997)
• [Publications] Suzuki,Y.ラ: "Modulation of actin filament sliding by mutations of the SH2 cysteine in Dictyostelium myosin II." Biochem.Biophys.Res.Commun.234・3. 701-706 (1997)
• [Publications] Suzuki,Y.ラ: "Hydrolysis of AMPPNP by the motor domain of ncd,a kinesin-related protein." FEBS Lett.409・1. 29-32 (1997)
• [Publications] Ichikawa,T.ラ: "Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the sarcosine oxidase from Bacillus sp.NS-129." J.Struct.Biol.120. 109-111 (1997)