減数分裂時に誘導されるDNA複製開始能の分子的実体とその抑制機構

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09264215
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 加藤 順也 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (00273839)
• Keywords: アフリカツメガエル / 卵成熟 / サイクリン / サイクリン依存キナーゼ / E2F / DNA複製能 / 減数分裂

Research Abstract

体細胞分裂のDNA複製開始を制御することが判明しているG1制御因子(Cdkインヒビター、cyclinD、cyclinE、cdk4、cdk2、E2F-1、DP-1、pRbなど)が、減数分裂過程中、MI期にて誘導されるDNA複製能に関与する可能性を検討するために、それぞれの組み換え蛋白質を大腸菌およびバキュロウイルスの発現系を用いて発現・精製し、未成熟卵にマイクロインジェクション後、卵生熟やDNA複製開始能の誘導に与える効果を解析した。その結果、ドミナントネガティブE2F、あるいは、Cdkインヒビターを用いた実験から、カエル卵に存在するE2F様因子とCdk2活性が、MI期にて誘導されるDNA複製能に関与する結果を得た。また、E2F-1とサイクリンEを導入した場合、それぞれ単独では効果が見られなかったが、同時に注入するとDNA複製の開始を誘導した。この結果は、カエル卵においては、E2F活性のみでは不十分であるが、サイクリンE/Cdk2複合体と協調するとDNA複製開始を誘導できること、この系においてはサイクリンEの発現はE2Fに依存しないこと、さらにはE2Fの標的遺伝子にサイクリンE以外のものが存在することを示している。カエル卵においては、ほとんどの蛋白質の発現はすでに存在しているmRNAのpolyA付加により制御されることが知られているので、外部から導入した転写因子により活性化された遺伝子を同定するには理想的な系である。この利点を生かし、E2FとサイクリンEを注入した卵と、未処理卵からRNAを抽出し、ディファレンシャルディスプレイ法によりその発現が特異的に上昇した遺伝子の断片を4種類同定した(仮称 CET-1、-2、-3、-4)。このうち比較的強く誘導された遺伝子断片(CET-1と2)をクローニングし、現在、完全長のcDNAを単離し、解析中である。