機能探索分子設計の為のアクチビン情報伝達系を構成する蛋白質の立体構造の解明

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09273218
• Research Institution: Nagaoka University of Technology
• Principal Investigator: 三井 幸雄 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (40012637)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 千田 俊哉 長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (30272868)
• Keywords: アクチビン / 情報伝達系 / 機能探索分子設計 / 蛋白精造 / 蛋白結晶学

Research Abstract

精製したActivinとfollistatinを用いてActivin-follistatin複合体の結晶化を試みた。結晶化は、スクリーニングキットを使用して行った。しかし、結晶を得ることができなかった。そこで、沈殿剤として、硫安、PEGを使用して網羅的に結晶化条件の探索を行い、千以上の条件を探索したが、やはり結晶を得ることは出来なかった。これは、follistatinに糖鎖が付加していることが結晶化に悪影響を及ぼしていると考えられる。そこで、糖鎖を持たないfollistatinを作成して結晶化を行うことにした。具体的には、site-directed-mutagenesisで糖鎖付加部位であるアスパラギン酸に変異を導入することでアラニンに変換し、これをバキュロウイルスを用いた発現系を用いて発現させることを農水省・蚕糸昆虫研の冨田博士の協力を得て行った。その結果、本発現系により活性をもつ糖鎖の除去されたfollistatinを生産することが可能なことを確認した。現在、結晶化に使用するための大量精製の条件を検討している。
また、T7プロモータを用いてActivin受容体の細胞内に存在するkinase domainの発現系を構築し、大腸菌BL21(DE3)による発現を試みた。しかし、発現量が少なく、結晶化に使用可能な程度の大量な蛋白質を得ることが出来ていない。現在、培養条件の検討を含め、大量精製するための条件検討を行っている。

Research Products

• [Publications] Mitsui,Y. & Senda,T.: "Elucidation of the basic three-dimensional structure of Type I interferons and its functional and evolutionary implications." J.Interferon and Cytokine Res.17. 319-326 (1997)
• [Publications] Nandhagopal,N., Senda,T., Hatta,T., Yamada,A., Masai,E., Fukuda,M. & Mitsui,Y.: "Three-dimensional structure of microbial 2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienolc acid (HPDA) hydrolase (BphD enzyme) from Rhodococcus sp. stratin RHA I,in the PCB degradation pathway." Prot.Japan Acad.Series B. 73. 154-157 (1997)