クロマチンを介した転写因子による転写調節機構のin vitroの解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09277220
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 青田 聖恵 (浦 聖恵) 久留米大学, 医学部, 助手 (80289363)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 豊田 哲也 久留米大学, 医学部, 教授 (00197972)
• Keywords: 転写 / クロマチン / ヒストン / RNAポリメラーゼIII / ヌクレオソーム / SP6RNA / アフリカツメガエル / アセチル化

Research Abstract

近年、転写調節因子の中に、SWI/SNIF複合体のようにクロマチンの構造変化に関与するものや、p300/CBPあるいはRbp3pのようにヒストンのアセチル化および脱アセチル化の活性を有している因子が見つかってきた。これらにより転写調節機構解明に向けた転写因子からの研究と遺伝子のクロマチン構造からの研究がまさに交差し合うようになった。
私はin vitroでクロマチン鋳型を用いて転写活性とクロマチン構造を同時に解析することが可能な2つのポジショニングしたヌクレオソームからなる極めて単純なdinucleosomeの系を用いて、以下の3点についてクロマチンを介した遺伝子の転写調節機構の研究に取り組んだ。
1、アセチル化の程度の異なるヒストンをHeLa細胞から調整し、dinucleosomeを再構成して構造比較を5つの方法(2次元アクリルアミドゲルを用いたヌクレオソーム移動性解析、ヌクレアーゼ消化速度によるヌクレオソーム安定性解析、ヌクレオソームポジション解析、hydroxylradical footprinting、アガロースゲルを用いたリンカーヒストンの結合解析)で行った。その結果アセチル化による構造の変化は何も検出されなかった。しかしXenopus oocyte核抽出液を用いたin vitroの転写では、アセチル化により5S遺伝子の転写が活性化された。
2、ビオチン標識したオリゴプローブを用いてPCRでDNA断片を増幅し、non-RIのdinucleosomeを作製、原子間力顕微鏡によるdinucleosomeの構造解析を行った。
3、dinuclelsomeの一方の5S遺伝子のプロモーターにSP6プロモーターを挿入して5S遺伝子のプロモーターを破壊した。これにより、2種類の異なるRNA polymeraseで転写される遺伝子を1つずつ含む新しいDNA鋳型を作製した。

Research Products

• [Publications] Kiyoe Ura: "Histone acetylation:influence on transcription by RNA polymerase III,nucleosome mobility and positioning,and linker histone dependent transcriptional repression" EMBO J.16. 2096-2107 (1997)