リソゾームカテプシン群による神経細胞死の新たな制御機構について

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09280218
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 内山 安男 大阪大学, 医学部, 教授 (10049091)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大沢 良之 大阪大学, 医学部, 助手 (30273642) ; 渡部 剛 大阪大学, 医学部, 助教授 (80220903)
• Keywords: 海馬CA1錐体細胞 / リソソーム / アポトーシス / PC12細胞 / カテプシンB / カテプシンD / プロテアーゼインヒビター / アンチセンス

Research Abstract

私達は、短時間虚血に伴う海馬CA1錐体細胞の細胞死では、アポトーシスに特有な形態変化(細胞の縮小化、核クロマチンの凝縮、アポトーシス小体の形成等)に先立ち、細胞質にオートファジ-小体が形成されることを明らかにした。私達は、細胞死の過程でリソゾームが果たす役割を解析するため、ラット褐色細胞腫由来のPC12細胞を用いて検討した。同細胞は、無血清培地で低密度培養すると24時間以内にほんとどの細胞はアポトーシスに陥ることが知られている。この系で細胞死に陥る際に働くcaspaseを同定するため、caspase-1と-3のインヒビターとして知られるacety1-YVAD-choおよびacety1-DEVD-cho(YVADとDEVD)を用いて検討したところ、DEVDにより生存率が上昇し、caspase-3様のプロテアーゼが関与することがわかった。さらに、リソゾームカテプシン群が如何に関与するかを同定するため、システインプロテアーゼやアスパルギン酸プロテアーゼのインヒビターであるE64、ロイペプチンおよびペプスタチンAを各々培地に添加したが生存率に変化はなかった。しかし、DEVD存在下でE64やロイペプチンを添加すると生存率は有意に低下した。さらに、ペプスタチンAを添加すると生存率は上昇した。そこで、細胞死に陥る系でカテプシンB、L、Dの活性を調べたところ、LとDは培養開始後3時間ですでに上昇するが、Bは1/5に活性が低下した。このことから、カテプシンBの特異的インヒビターであるCA074をこの系に用いた結果、DEVD存在下で生存率が低下し、ペプスタチンAで元に戻ることがわかった。カテプシンBとDによって制御される細胞死の経路をさらに確かめるためにこれら酵素のアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成したところ、これら酵素の蛋白合成を抑制する配列を見い出すことができ、これらのアンチセンスの実験から、カテプシンDが細胞死惹起因子として、また、Bがそれを抑制することがわかった。

Research Products

• [Publications] Hibino,H.: "An ATP-dependent inwardly rectilying potassium channel,KAB-2(Kir4.1),in cochlear stria vascularis of inner ear:its specific subcellular localization and correlation with the tormation of endocochlear potential." J.Neurosci.17. 4711-4721 (1997)
• [Publications] Sato,K.: "Immunocytochemical localization of lysosomal cysteine and aspartic proteinases,and ubiquitin in rat epidermis." Arch.Histol.Cytol.60. 275-288 (1997)
• [Publications] Ishii,M.: "Expression and clustered distribution of an inwardly rectifying potassium channel,KAB-2/Kir4.1,on mammalian retinal Muller cell membrane:Their regulation by insulin and laminin signals." J.Neurosci.17. 7725-7735 (1997)
• [Publications] Satoh,T.: "Changes in mitochondrial membrane potential during oxidative stress-induced apoptosis in PC12 cells." J.Neurosci.Res.50. 413-420 (1997)
• [Publications] Sato,N.: "Cloning and expression of the cDNA encoding rat caspase-2." Gene. 202. 127-132 (1997)
• [Publications] Nishimura,I.: "Degeneration in vivo of rat hippocampal neurons by wild-type Alzheimer amyloid precursor protein overexpressed by adenovirus-mediated gene transfer." J.Neurosci.(in press).
• [Publications] Nitatori,T.: "ed.Motta,P.University La Sapienza of Rome,Rome," Apoptosis of CA1 pyramidal neurons after transient ischemia.Recent advances in morphology of cells,tissues and organs, 177-181 (1997)