Ash/Grb2下流のシグナル伝達の構造生物学的研究

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09308023
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 稲垣 冬彦 (財)東京都臨床医学総合研究所, 生理活性物質研究部門, 研究員 (70011757)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺澤 宏明 (財)東京都臨床医学総合研究所, 生理活性物質研究部門, 研究員 (10300956) ; 小椋 賢治 (財)東京都臨床医学総合研究所, 生理活性物質研究部門, 研究員 (50270682) ; 畠中 秀樹 (財)東京都臨床医学総合研究所, 生理活性物質研究部門, 研究員 (00260331)
• Keywords: Ash / Grb2 / NMR / X線結晶構造解析 / X線小角散乱 / SH2 / SH3 / 動的構造

Research Abstract

Ash/Grb2の溶液構造をNMR法とX線小角散乱を用いて解析した。
Ash/Grb2は大腸菌を用いて大量発現、大量調整をおこなった。SH3結合ペプチド、SH2結合ペプチドを加えることにより、分子会合を抑え、NMR、X線小角散乱の測定試料として用いた。^<15>Nラベル体、^<13>C/^<15>N二重ラベル体を調整し、HMQCスペクトルを測定した。Ash/Grb2のスペクトルは、個々のドメインのスペクトルとよく対応していた。この事は、Ash/Grb2の各ドメインは溶媒に自由に接していることを示している。既にAsh/Grb2については、X線結晶構造が報告されているが、これによれば、SH3-SH2-SH3の各ドメインはコンパクトにまとまった構造をとっていて、特にSH3相互が互いに近接した構造をとることが報告されている。今回の実験結果は、少なくとも溶液中では、この様な構造を取り得ないことを示している。そこで、この点を確かめるために、X線小核散乱の実験を行った。X線小核散乱の実験より求めた重原子間の距離分布は、80Åまでにわたっていた。X線結晶構造の結果に基づいて計算した距離分布は、せいぜい60Å程度までであり、Ash/Grb2は溶液では結晶と異なる構造をとりうることを示している。そこで、溶液構造についての知見を得るためAsh/Grb2の動的構造のシュミレーションを行った。SH3-SH2のリンカーとして3残基、SH2-SH3間のリンカーとして5残基のアミノ酸について二面角を変化させ、シュミレ-テッドアニーリングの手法を用いて、とりうる構造を検討した。得られた構造のアンサンブルについて求めた距離分布は、実験結果を比較的よく説明した。以上より、Ash/Grb2は溶液中では、フレキシブルな構造をとることを示した。この様なフレキシブルな構造は、標的蛋白との結合に有利であると考えられる。

Research Products

• [Publications] Odaka,M.: "Ligand-binding enhances the affinity of dimerization of the extracellular domain of the epidermal growth factor receptor." J.Biochem.122. 116-121 (1997)
• [Publications] Hatanaka,H.: "Solution structure of ferredoxin from the thermophilic cyanobacterium Synechococcus elongatus and its thermostability." J.Mol.Biol.268. 922-933 (1997)
• [Publications] Ogura,K.: "Comformation of an Shc-derived phosphotyrosine-containing peptide complexed with the Grb2 SH2 domain." J.Biomol.NMR. 10. 273-278 (1997)
• [Publications] Iwasaki.W.: "Solution structure of midkine,a new heparin-binding growth factor" EMBO J.16. 6936-6946 (1997)
• [Publications] Ichikawa,S.: "Solution Structure of Derf2,the major mite allergen for atopic diseases." J.Biol.Chem.273. 356-360 (1998)
• [Publications] Mizoguchi,T.: "The Structure of the aggregate form of bacteriochlorophyII c showing the Q_y absorption above 740nm as determined by the ring-current effects on ^1H and ^<13>C nuclei and by ^1H-^1H Intermolecular NOE correlations." Photocem.Photobiol.67(2). 239-248 (1998)
• [Publications] 稲垣冬彦: "SH3によるプロリンに富む配列の認識(構造生物学とその解析法)" 共立出版(京極好正、月原富武編), 7(192) (1997)
• [Publications] 寺沢宏明: "プレックストリン相同領域の立体構造と基質認識(蛋白質 核酸 酵素)" 共立出版(石川春律、鈴木和男、中西守、猪飼篤編), 8(350) (1997)