高活性・基質立体特異性を発現する両親媒性プラスチック酵素創製への物理化学的研究

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09450317
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 大久保 捷敏 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (00040402)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小瀧 努 京都大学, エネルギー理工学研究所, 助教授 (70170264)
• Keywords: プラスチック酵素 / 人工抗体触媒 / 遷移状態類似体 / エステラーゼ活性 / 基質立体特異性

Research Abstract

標記研究において平成9年度は、ラセミ型アミノ酸エステル基質に対してL一体優先の高活性・基質立体特異性(いわゆるエステラーゼ活性)を発現する両親媒性プラスチック酵素(人工抗体触媒)の創製研究に集中し、以下の研究を通じて両親媒性プラスチック酵素の創製及び活性・特異性評価を行った。すなわち、
(1)ラセミ型アミノ酸エステル基質として、ベンジルオキシカルボニル(Z)保護基を持つロイシンp-ニトロフェニルエステル(Z-LD-Leu-PNP)を合成し、L体基質(Z-L-Leu-PNP)に対する両親媒性プラスチック酵素の優先的エステラーゼ活性・基質立体特異性に注目した。
(2)両親媒性プラスチック酵素の反応キャビテイー形成用の鋳型として、Z-LD-Leu-PNP加水分解反応の遷移状態類似体であるラセミ型フェニル1-ベンジルオキシカルボニル-3-メチルペンチルフォスフォネート(LD-TSA)を合成し、プラスチック酵素の触媒活性部位モノマーであるメチルN-アクロイル-L-ヒスチジネート(L-Hisモノマー)とDMSO溶媒中で予め水素結合型L-TSA・L-Hisモノマー複合体を形成させ(L-TSAを優先した複合体形成がNMR解析により判明)、その後アクリツアミド、N-(3-トリメチルアミノプロピル)アクリルニトリル、4級アンモニ-ム型アクリルアミド及びN,N-エチレンビス(2-プロペンアミド)架橋剤を添加し、AIBNによるラジカル重合(60℃)及び酢酸エチル-メタノールによる鋳型・未反応物質の除去を経て、8.6%架橋の両親媒性プラスチック酵素を創製した。
(3)創製したプラスチック酵素は極めて高い水溶性を示し、10%DMSO水溶液(pH7.15,30℃)におけるZ-LD-Leu-PNPに対するエステラーゼ活性評価において、ミハエリスーメンテン定数10^4Km=2.2mol dm^<-3>,10^4k=6.5s^<-1>、k/k^<uncat>=13.4及び速度定数比L/D=12の優れたL体基質特異的酵素反応を呈示し、より適切な両親媒性プラスチック酵素の設計により優れた活性・基質立体特異性の発現が可能であることが判明した。
(4)創製した上記両親媒性プラスチック酵素の優れたZ-L-Leu-PNP基質特異性は、アミノ酸側鎖が異なるエステル基質(Z-LD-Ala(or Phe)-PNP)及びアシル保護基が異なる各種ロイシン基質(C_n-LD-Leu-PNP:C_nは各種鎖長を持つアシル保護基)に対する低いエステラーゼ活性からも評価された。

Research Products

• [Publications] K.Ohkubo, T.Kodaki: "Catalytic Activity and Stereospecificity of Novel Soluble Cross-linked Polymer Catalysts Imprinted by a Transition-state Analogue for Stereoselective Hydrolysis of Enantiomeric Amino Acid Esters" Journal of Chemical Society,Perkin Transactions 2. (発表予定).
• [Publications] K.Ohkubo, T.Kodaki: "Substrate Strucural Effects on Stereospecific Activity of Novel Soluble Plastic Enzymes Imprinted by a Transition-state Analogue for Stereoselective Hydrolysis of Enantiomeric Amino Acid Esters" Journal of Molecular Catalysis. (発表予定).