1998 Fiscal Year Annual Research Report
枯草菌蛋白質分泌過程におけるSRP・SRP受容体系とSec分泌系との相互作用
| Project/Area Number |
09460043
|
|---|
| Research Institution | University of Tsukuba |
|---|
Principal Investigator |
山根 國男 筑波大学, 生物科学系, 教授 (20013336)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 幸治 筑波大学, 生物科学系, 講師 (40212097)
|
|---|
| Keywords | 枯草菌Bacillus subtilis / 分泌蛋白質 / シグナル認識粒子 / シグナルペプチド / Ffh / SRP相同因子 / 蛋白質分泌機構 |
|---|
| Research Abstract |
枯草菌に見られるα-アミラーゼやプロテアーゼなど有用酵素の高い蛋白質分泌能はSRP・SRP受容体系とSec蛋白質分泌系の共同作業によって初めて可能になると考えられる。新たに合成された分泌蛋白質前駆体はそのN末端に存在するシグナルペプチド部分でSRPを構成するFfh蛋白質によって認識され、SRP受容体と結合し細胞膜へ運搬され、Sec蛋白質群から構成される細胞膜上の蛋白質分泌装置によって膜を通過し、培地中へ分泌されると予想される。このカスケードを解明するために、基質である前駆体蛋白質をコードする遺伝子を組み換え技術で構築した。シグナル配列部分は大腸菌β-ラクタマーゼ(Bla)、外膜蛋白質OmpA、枯草菌分泌蛋白質アルカリ性プロテアーゼ(AprE)、枯草菌胞子形成蛋白質ペニシリン結合蛋白質5ﾟ(PBP5ﾟ)、好アルカリ性バチルスBacillus sp.#1011サイクロデキストリン合成酵素(CGTase)を用いた。次に完成型酵素部分はβ-ラクタマーゼを使用し、C末端にはNi-NTA力ラムによって簡単に純化できるようにHig・Taqを導入した。得られた融合遺伝子をBlaH6、OmpA-BlaH6、AprE・BlaH6、PBP5ﾟ・BlaH6、CGT-BlaH6とした。これらの融合遺伝子を大腸菌SecA条件変異株に導入し、IPTGによって遺伝子を誘導発現させた。その結果、許容条件では完成型酵素を、また非許容条件では前駆体蛋白質を生産するので、これらをNi-NTAカラムで純化し、95%以上の純度の標品を得た。一方枯草菌SecAおよびFfhを純化し、精製した。
得られた標品を用いたin vitro系で、SecA、Ffhは5種類の全ての融合蛋白質前駆体とは複合体を形成するが完成型蛋白質とは複合体を形成しないことを明らかにした。またSecA・前駆体の複合体の形成をFfhが促進されることがわかった。そこで、前駆体はまずFfhと複合体を形成し、前駆体はSecAに引き渡されるというカスケードが考えられた。
|
-
[Publications] Shu Ishikawa: "Regulation and characterization of a newly deduced cell wall hydrolase gene (cwlJ) which affects the germination of Bacillus subtilis apores." J.Bacteriol.180. 1375-1380 (1998)
-
[Publications] Akihiro Oguro: "Bacillus subtilis RNase III cleaves both 5'-and 3'-sites of the small cytoplasmic RNA precursor." J.Biol.Chem.273. 19542-19547 (1998)
-
[Publications] Keiko Haga: "Analyses of the reaction mechanism based on the X-ray structure of acrbose complexes of wile-type and mutant cyclodextrin glucanotransferases from alkalophilic Bacillus ap.#1011.(in Japanese.Abstract in English)" J.Appl.Glycosci.45. 177-183 (1998)
-
[Publications] Keigo Bunai: "Enhancing effect of Bacillus subtilis Ffh,a homoloque of SRP54 of mamnalian signal peptide recognition particle, on the binding of SecA to presecretory proteins in vitro." J.Biochemistry.in press.(1999)
-
[Publications] Kouji Nakamura: "Depletion of Bacherichia coli 4.5S RNA leads to an increase in the amount of protein elongation factor EF-G associated with ribosomes." Eur.J.Biochemistry. 259. 543-550 (1999)
-
[Publications] 山根國男: "ヒト・ゲノム解析と微生物ゲノムの解析" 大阪医薬品協会会報. 589. 2-8 (1998)
