1997 Fiscal Year Annual Research Report
立体構造解析に基づくアミノ酸脱水素酵素類の基質特異性の改変
| Project/Area Number |
09460052
|
|---|
| Research Institution | Toyama Prefectural University |
|---|
Principal Investigator |
浅野 泰久 富山県立大学, 工学部, 教授 (00222589)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
米田 英伸 富山県立大学, 工学部, 助手 (50285160)
加藤 康夫 富山県立大学, 工学部, 助教授 (20254237)
|
|---|
| Keywords | アミノ酸脱水素酵素 / オピン脱水素酵素 / X線結晶構造解析 / 部位特異的変異 / 遺伝子クローニング / キメラ酵素 / フェニルアラニン脱水素酵素 |
|---|
| Research Abstract |
フェニルアラニン脱水素酵素(PheDH)の改変I
グルタミン酸脱水素酵素(GluDH)の構造解析に基づき、PheDHを出発酵素としてロイシン脱水素酵素(LeuDH)様酵素への変異について研究した。基質ポケットの周辺で、全ての酵素に共通ではない残基に注目した。例えば、GluDHおよびLeuDHの活性中心付近にある163Aや377Vは、PheDHでは、それぞれGやLである。そこで、これらの残基をGluDHおよびLeuDHに見られるアミノ酸へ改変した。その結果、これらの変異型酵素は、L-フェニルアラニンに対する活性が低下したが、脂肪族アミノ酸に対する活性が増大した。
オピン脱水素酵素(ODH)の結晶構造解析
ODHの一次構造上の類似性をコンピュータを用いてデータベースに検索した。本酵素は、植物のクラウンゴールに存在する40-kDa Protein、D-リゾピン脱水素酵素、D-ノパリン脱水素酵素等と類似性を有しているので、一次構造上に見られる共通残基および活性中心にあると考えられる残基を絞り込んだ。Arthrobacter sp.IC由来の本酵素遺伝子を大腸菌で発現させ、酵素を大量に精製した。ハンギング・ドロップ蒸気拡散法を用い、硫安34-40%、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)、17℃の条件下、約2週間で0.5×0.3×0.3mm程度の結晶が得られ、それらは良好な回折像を与えた。ODHの結晶は回折像を良好に与えため、X線構造解析を急速に進展させた。結晶は斜方晶系に属し、空間群はP2_12_12、格子定数(Å)はa=104.9、b=80.0、c=45.5であった。NAD+存在下、非存在下において得られた結晶から、いずれも1.8Åの分解能のデータを得た。
|
-
[Publications] S.Y.K.Seah: "Alternation in substrate specificty of phenylalanine dehydrogenase by site directed mutagenesis" FEBS Letters. 370. 93-96 (1995)
-
[Publications] Y.Asano: "Screening for novel amino acid dehydrogenases-soil of Toyama Prefecture as a source of microorganisms- (in Japanese)" Bulletin of Toyama Prefctural University. 6. 101-106 (1996)
-
[Publications] K.Nakamura: "Quantitation of L-amino acids by cycling between an aminotransferase and a dehydrogenase : application to the determination of L-phenylalanine in human serum" Analytical Biochemistry. 234. 19-22 (1996)
