DNA転写調節因子を介する小胞体膜合成制御機構の解明

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09470005
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 金村 秦輔 関西医科大学, 医学部, 教授 (50027091)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 仁平 美果 関西医科大学, 医学部, 助手 (20274194) ; 門藤 裕子 関西医科大学, 医学部, 助手 (30309249) ; 高森 康晴 関西医科大学, 医学部, 助手 (50309233) ; 渡辺 淳 関西医科大学, 医学部, 助教授 (40148557)
• Keywords: Cytochrome P450 2B2 / acyltransferase / 小胞体膜 / Phenobarbital / mRNA / in situ hybridization / luminessence

Research Abstract

1) 肝細胞cytochrome P-450(p-450)2B2のc-DNA低ホモロジー領域nucleotideに相補的なprobeを人工合成し、このprobeを用いてphenobarbilal (PB)80mg/kgを1回投与したラットの肝細胞におけるP-450 2B2m-RNA発現量をIuminessence in situ hybridzation(LISH)法で測定した。P-450 2B2のmRNA発現の増加は肝小葉中心部の肝細胞にほぼ限局して観察され、P-450 2B2の発現と膜の増生が同じtrigger(PB)によって引き起こされることが示された。また、肝細胞lysateにおけるglycerophosphate acyltransferase(GAT)活性はPB投与後上昇し、その活性上昇がGATの転写促進によるものであることがmRNA量の解析から明らかとなった(交付申請書記載の研究実施計画5項に対応)。
2) 上記の実験結果を計量形態学的手法を用いて算出した小胞体膜表面積(小胞体量)と比較した。中心部肝細胞におけるP-450 2B2の発現増加(約10倍)はと膜の増生(1.5倍程度)と単純に比例していなかった。現在、GAT mRNAの増加と小胞体膜増生との関係を細胞レベルで解析中である(交付申請書記載の研究実施計画6項に対応)。
3) 肝細胞cDNAライブラリから得たP-450 2B2およびGAT遺伝子のヌクレオチド断片をプローブとして肝細胞genornic DNAライブラリをスクリーニングし、DNA断片をPCRで増幅した後、5'flanking領域におけるヌクレオチド配列を比較した。GAT遺伝子の転写開始点付近にP-450 2B2で見出されたproximla promotor配列と類似した構造の存在を認めた。現在、P-450 2B2転写開始点上流約2KBに存在するPB regulatory element(PBRE)配列がGATにも存在するかどうかを検索中である。また、reporter遺伝子を繋いだプラスミド(pCAT)に欠損DNA断片を組み込んでE.Collに導入し、reporler遺伝子の発現の程度を調べつつある。(交付申請書記載の研究実施計画7および8項に対応)。

Research Products

• [Publications] Mino K: "Effect of 3-methylchoalnthrene administration on expression of cytochrome P-450 isoforms induced by phenobarbital in rat hepatocytes" J Histochem Cytochem. 46. 1151-1160 (1998)
• [Publications] Watanabe J: "Determination of accuracy of quantiative immunohistochemical results with an antigen-immobilized filter model system." Acta Anat Nippon. 73. 25-31 (1998)
• [Publications] Asaka Y: "Localization of xenobiotic responsive element-binding protein in rat hepatocyte nuclei after methylcholanthrene administration as revealed by in situ Southwestern hybridization." J Histochem Cytochem. 46. 825-832 (1998)
• [Publications] Shibano K: "Culture of stromal cells derived from medullary cavity of human long bone in the presence of 1,25-dihydroxyvitamin D3,recombinant human bone morphogenetic protein-2 or ipriflavone." Bone. 22. 251-258 (1998)