C型肝炎ウイルスの細胞内増殖動態に関する超微形態学的研究

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09470134
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 渡邉 省三 三重大学, 保健管理センター, 教授 (20134934)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 生駒 治朗 三重大学, 医学部, 助手 (80283521) ; 垣内 雅彦 三重大学, 医学部, 講師 (70214244)
• Keywords: C型肝炎ウイルス / HCVRNA / HCVコア蛋白質 / IMY細胞 / 金コロイド免疫電顕法

Research Abstract

C型肝炎ウイルス(HCV)全遺伝子のcDNAをT7プロモーターの下流に導入した発現ベクターをヒト肝細胞由来融合細胞(IMY細胞)にトランスフェクションし,この細胞にT7RNAポリメラーゼ発現組換えアデノウイルスあるいはワクシニアウイルスを感染させた。そして,この培養細胞系では,HCV遺伝子にコードされているすべてのHCV構造蛋白質と非構造蛋白質が発現していることを蛍光抗体間接法によって確認するとともに,プラス鎖およびマイナス鎖のHCVRNAが細胞内に存在することを同定し得た(4th International Meeting on Hepatitis C Virus and Related Viruses,1997)。この成績は,上記培養細胞系においてHCVの遺伝子が複製している可能性を強く示唆しているものであることから,この細胞を検索対象として,HCV粒子の細胞内局在についての超微形態学的検討を行なった。抗HCVコア抗体を用いた金コロイド免疫電顕法では,細胞質内の無構造基質領域にHCVコア抗原が検出され,その基質領域内部には30〜35nmの電子密度の高いコア様粒子が存在することが観察された(4th International Meetung on Hepatitis C Virus and Related Viruses,第33回日本肝臓学会総会,1997)。そして,通常透過電顕法によってHCVcDNAを導入発現したIMY細胞の小胞体内および空胞内に直径50〜60nmのウイルス様粒子とその出芽像を捕えたので,抗HCVエンベロープ抗体を用いた免疫電顕法によるHCVビリオンの同定を試みている。また、上記IMY細胞培養上清のショ糖度勾配遠心法による解析では、比重1.05,1.12〜1.16,1.25の分画にHCVRNAとHCVコア蛋白質のピークが認められた(第20回日本分子生物学会年会,1997)ことから,これら分画試料中のHCV粒子を免疫電子顕微鏡的に確認すべく研究を進めているところである。

Research Products

• [Publications] Kohara M,Watanabe S, et al: "Detection and passage of virion-like structure in transfected IMY cells with entire HCV genome" 4th Internatioal Meeting on Hepatitis C Virus and Related Viruses-Molecular Virology and Pathogenesis. Abstracts. 31-31 (1997)
• [Publications] Kaito M,Watanabe S, et al: "Propagation features of hepatitis C virus in IMY-4 cells transfected with entire HCV genome:observation by immunogold electron microscopy" 4th Internatioal Meeting on Hepatitis C Virus and Related Viruses-Molecular Virology and Pathogenesis. Abstracts. 85-85 (1997)
• [Publications] Ishida S,Watanabe S, et al: "Hepatitis C virus core particle detected by immunogold electron microscopic study" 4th Internatioal Meeting on Hepatitis C Virus and Related Viruses-Molecular Virology and Pathogenesis. Abstracts. 86-86 (1997)
• [Publications] 垣内雅彦,渡邉省三,他: "ヒト肝細胞由来IMY細胞におけるHCV増殖に関する免疫電子顕微鏡的研究" 肝臓. Supple・1. 86-86 (1997)
• [Publications] 藤田尚己,渡邉省三,他: "HCV浮遊密度に及ぼすParaformaldehyde処理の影響" 肝臓. Supple・3. 85-85 (1997)
• [Publications] 垣内雅彦,渡邉省三,他: "C型肝炎とG型肝炎のpウイルス粒子の構造" Modern Physician. 17・9. 1047-1050 (1997)