細胞移動の制御に果たすα2-プラスミンインヒビタの役割の分子生物学的解析

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09470234
• Research Institution: Jichi Medical School, School of Medicine
• Principal Investigator: 坂田 洋一 自治医科大学, 医学部, 助教授 (40129028)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 窓岩 清治 自治医科大学, 医学部, 助手 (70296119) ; 三室 淳 自治医科大学, 医学部, 講師 (10221607)
• Keywords: アンギオスタチン / プラスミン / α2プラスミンインヒビタ / 細胞遊走 / 血管内皮細胞

Research Abstract

プラスミノゲン(PG)ノックアウトマウスにおいては、細胞移動の極端な遅延が見られる。種々の解析から、プラスミン活性が移動に重要であることが示唆された。一方、プラスミン、或いは、組織メタロプロテアーゼによるPGの分解産物であるアンギオスタチン(AST)は、新生血管の増殖抑制のみならず、focal adhesion kinaseを活性化することにより、細胞の遊走をも抑制することが報告された。ASTは、プラスミンのクリングル1+2+3よりなり、この構造中にはα_2-プラスミンインヒビタ(α_2-P1)と特異的に結合する部位が存在する。そこで、本年は,プラスミンとAST両者の細胞遊走におけるα_2-P1の制御を観察した。まず、PGをエラスターゼで分解し、種々のカラムクロマトグラフィを利用してASTを精製した。その活性は、牛脳微小血管内皮細胞のfibroblast growth factor(FGF)による増殖抑制より判定した。予め、ASTと人血管内皮細胞をα_2-P1の存在、非存在下に反応させ、これをフィブロネクチンをコーティングしたpolyvinylpyrrolidine-freeのnucleopore filterで隔離した上室に加え、Boyden chamber法を若干手直しして細胞の遊走を観察した。α_2-P1は有意に、ASTの遊走抑制作用を中和した。しかしながら、ASTとα_2-P1の特異的結合部位を競合するアミノカプロン酸には全く中和作用は見られず、α_2-P1はASTと細胞のインテグリンとの結合部位を直接阻害するのではなく、立体構造的に影響を与えている可能性が示唆された。現在、ASTそのものの、モノクロナル抗体を作製し、ASTの細胞への結合部位の同定を進めている。同様の方法を用いて、lipopolysaccharideで刺激した内皮細胞の遊走に与えるα_2-P1の影響を観察した。α_2-P1が存在すると有意に遊走が抑制された。細胞にセレクチンを介して結合したα_2-P1が機能している可能性が示唆されたために、その分子機作を解析中である。

Research Products

• [Publications] YASUDA,T: "Fibrinolytic components in nasal mucosa and nasal secretion." Histochem Cell Biol. 110. 449-455 (1998)
• [Publications] ARAI,K: "Role of kringle domain in plasminogen activation with staphylokinase." J Biochem. 123. 71-77 (1998)
• [Publications] MADOIWA,S: "Effect of carbohydrate side chain of tissue-type plasminogen activator on its interaction with plasminogen activator inhibitor-1." Fibrinolysis & Proteolysis. 12. 17-22 (1998)
• [Publications] SHITAKA,M: "Structural studies of the interaction of normal and abnormal human plasmins with basic pancreatic trypsin inhibitor." Chem Pharm Bull,. in press. (1999)
• [Publications] MADOIWA,S: "Developmental expression of plasminogen activator inhibitor-1 associated with thrombopoietin-dependent megakaryochtic differentiation." Blood,. in press.(1999)
• [Publications] MIYATA,T: "Characterization of recombinant human thrombomodulin expressed on human endothelial cells transduced with adenovirus vector." Thromb Haemost,. in press. (1999)
• [Publications] MIMURO,J: "A new type of Ser substitution for γArg-275 in fibrinogen Kamogawa I characterized by impaired fibrin assembly." Thromb.Haemost,. in press.(1999)
• [Publications] 坂田洋一(分担): "造血幹細胞" 南江堂, 272 (1998)