原核細胞cDNAライブラリーの構築とサブトラクション法による遺伝子カタログ化-P.gingivalisの病原因子に関与する新規遺伝子のクローニング-

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09470405
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 安孫子 宣光 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (70050086)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木山 道子 日本大学, 松戸歯学部, 副手 (50256905) ; 平塚 浩一 日本大学, 松戸歯学部, 助手 (80246917) ; 城座 映明 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (50271333)
• Keywords: Porphyromonas gingivalis / subtraction / 差分化 / クローニング

Research Abstract

原核細胞のサブトラクション法を成功させるためには、いかにrRNAを取り除くかが鍵となる。昨年度までの研究成果から、遺伝子の差分化後、ストレプトアビジン(SA)を添加し、フェノール・クロロフォルムを加えることでビオチン(BT)/SA結合体を有機溶媒層に移行させる方法は、効率が十分ではなかった上に、この操作の繰り返しにより、試料の回収率が低下することが判明した。そこで本年度はSA磁気ビーズ(SA-B)にBT/SA結合体を結合させ、磁気によりその複合体を除去する方法を試みた。P.gingivalis 16S-23S rRNA断片の増幅は本菌染色体DNAを鋳型としてP.gingivalis 16S rRNA遺伝子内にフォワードプライマーをまた、5'末端をBTラベルしたリバースプライマーを大腸菌23S遺伝子保存領域内から設計しPCR増幅した。PCR産物はSA-Bに結合させた後、NaOHにて相補的な断片は除去した。差分化は、先に作成した1st.stranded cDNA、BT標識した対象の全RNAおよびSA-Bに結合させた一本鎖16S-23S rRNA断片の3種を混合し行い、BTラベルされた断片にハイブリしたcDNAはSA-Bに結合させた後、マグネットにて除去した。2回目以降は、新たにBTラベルの対象全RNAと16S-23S rRNA断片を加えて同様に計3回行った。精製後、2nd.stranded cDNA合成を行い、限界濾過カラムにて、300bp以下のcDNAを除去することで。合わせてtRNA由来のものを除去した後、クローニングした。現在、スクリーニングを行い、塩基配列を決定しているが。SA磁気ビーズを使用することにより16S、23S rRNA断片の除去効率が格段に高まったことで、差分化クローンに構造遺伝子断片が挿入されている割合が飛躍的に向上した。