人工変異により高度に活性化されたP450導入酵母による毒物特異的分子変換システム

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09480130
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 清水 透 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (40118956)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): ダフ サイモン 東北大学, 反応化学研究所, 助手 (50292298) ; 佐藤 秀明 東北大学, 反応化学研究所, 助手 (60271996) ; 佐上 郁子 東北大学, 反応化学研究所, 講師 (10143033)
• Keywords: 環境汚染化学物質 / シトクロムP450 / ハロエタン / トリクロロエチレン / NADPH-シトクロムP450還元酵素 / アゾ色素

Research Abstract

1.ラット肝臓由来のシトクロムP4501A2のcDNAをパン酵母であるSaccharomyces cerevisiaeに導入した。このパン酵母が環境汚染の主な原因になっているトリクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタンなどハロエタン類を分解する能力があるかを調べた。その結果、かなりの高い効率で分解することが明らかになった。又、酵母破砕液であるミクロゾーム分画は酵母自身よりも高い反応効率をしめした。多くの反応は還元的脱ハロゲン化反応であり、酸素がない条件下の方が高い反応活性をしめした。
2.シトクロムP4501A2の分子表面及び活性部位と推定される部位に存在するアミノ酸を他のアミノ酸へ変換した変異体を含むパン酵母を、各種ハロエタン類の還元的脱ハロゲン化に適用した所、いくつかの変異体ではその活性が野生型の20倍にも達することが明らかになった。
3.シトクロムP4501A2の精製した変異体を用いて、還元的脱ハロゲン化反応を詳細に調べた。アルコール反応系への添加により反応活性は40倍にも増加した。又、重水を添加したり、pHを変化させると反応活性が大きく変化した。これらの結果より、反応活性場におけるプロトンの寄与が大きいことが示唆された。
4.環境汚染物質の一つであるアゾ色素の分解にはシトクロムP4501A2は有用ではなく、むしろNADPH-シトクロムP450還元酵素が極めて効率良くアゾ色素を分解することが明らかになった。

Research Products

• [Publications] K.Yanagita, I.Sagami, T.Shimizu: "High Utility of Saccharomyces cerevisiae Harboring Rat Liver Cytochrome P450 1A2 cDNA in Haloethane Dehalogenations" Chemistry Letters. 561-562 (1997)
• [Publications] K.Yanagita, I.Sagami, T.Shimizu: "Distal Site and Surface Mutations of Cytochrome P450 1A2 Markedly Enhance Dehalogenation of Chlorinated Hydrocarbons" Archives of Biochemistry and Biophysics. 346. 269-276 (1997)
• [Publications] M.Umeno, K.Yanagita, I.Sagami, T.Shimizu: "Azo Reduction Catalyzed by Cytochrome P450 1A2 and NADPH-Cytochrome P450 Reductase" Journal of Inorganic Biochemstry. 67. 379-379 (1997)