1999 Fiscal Year Annual Research Report
人工異変により高度に活性化されたP450導入酵母による毒物特異的分子変換システム
| Project/Area Number |
09480130
|
|---|
| Research Institution | Tohoku University |
|---|
Principal Investigator |
清水 透 東北大学, 反応科学研究所, 教授 (40118956)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
ダフ サイモン 東北大学, 反応科学研究所, 助手 (50292298)
佐上 郁子 東北大学, 反応科学研究所, 講師 (10143033)
|
|---|
| Keywords | ハロエタン / チトクロムP450 / 環境汚染物質 / 環境ホルモン / 電子移動 / 脱ハロゲン化 / 遺伝子工学 / 薬物代謝 |
|---|
| Research Abstract |
ハロエタン、PCBなど化学発癌を引き起こす環境汚染物質を代謝、解毒するために、遺伝子工学的手法を用いて、脂肪酸を代謝し、薬物、毒物の代謝を司るネズミ肝臓P4501A2に類似した活性部位を保持したBacillus megaterium由来のP450BM3の酸化反応ドメインと、ネズミ脳由来の一酸化窒素合成酵素(NOS)の還元酵素ドメインより構成されるキメラ酵素を大腸菌に発現させた。このキメラ酵素の反応のon/offをカルシウム/カルモデュリンの添加/除去で調節しようとする試みである。このキメラ酵素は低スピン型として精製された。本来の基質であるアラキドン酸の添加により高スピン型に変化し、その解離定数は5μMであり、もとのP450BM3への結合力とは差がなかった。しかし、パルメチル酸やラウリル酸はキメラ酵素には結合しなく、P450BM3で見られなかった基質選択性がキメラ酵素では観測された。カルシウム/カルモデュリンの添加により、NOSではチトクロムc還元速度は10倍増加するが、キメラ酵素の場合5倍増加した。プテリン又はカルシウム/カルモデユリンの添加によりNADPH酸化速度は増加した。NADPH添加によるヘムの還元速度はアラキドン酸の存在下、存在しない場合よりも増加した。以上の結果は、この新しく構築されたキメラ酵素では、環境汚染物質の代謝、解毒に関係するNADPHからの電子伝達が、カルシウム/カルモデュリンで制御されるkとが見い出された。本系がハロエタンの脱塩素化に利用できる可能性が示唆された。
|
-
[Publications] T.Shimiz,I.Sagami,S.Daff: "Interdomain Electron Transfer of Fusion Proteins Composed of Oxygenase Domain of P450BM3 and NOS Reductase Domain"2nd Brain Seminar: Cytochrome P450. Vol.2. 2-4 (1999)
-
[Publications] S.Fujiwara,T.Shimizu,S.Daff: "Electron Tranfer in a Chimeric Protein Composed of P450 Oxygenase Domain and nNOS Reductase Domain"2nd Brain Seminar: Cytochrome P450. Vol.2. 68 (1999)
-
[Publications] T.Shimizu,I.Sagami,S.Daff: "Electron Transfer Modulation of the P450 System"Cytochrome P450-Biochemistry. Vol.11. 78 (1999)
-
[Publications] S.Fujiwara,I.Sagami,S.Daff: "Electron Transfer in the P450BM3-Nitric Oxide Synthase Chimeric Enzyme"Cytochrome P450-Biochemistry. Vol.11. 99 (1999)
