人工変異により高度に活性化されたP450導入酵母による毒物特異的分子変換システム

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09480130
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 清水 透 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (40118956)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松井 敏高 東北大学, 反応化学研究所, 助手 (90323120) ; 佐上 郁子 東北大学, 反応化学研究所, 講師 (10143033)
• Keywords: アゾ化合物 / チトクロムP450 / 環境汚染物質 / 環境ホルモン / 電子移動 / 窒素ラジカル / 遺伝子工学 / 薬物代謝

Research Abstract

NO合成酵素のアゾ色素分解反応を調べた。人工的に合成されたアゾ化合物は繊維産業、食品、化粧品など多くの分野に利用されている。しかし、いくつかのアゾ化合物は安定で分解し難く、環境汚染物質になっている。又、ジメチルアミノアゾベンゼンなどは体内で還元されるとラジカルが生成し、それがDNAと相互作用して強い発ガン活性を示す。我々は、脳において重要な働きをする一酸化窒素(NO)を合成する酵素、一酸化窒素合成酵素(NOS)、がアゾ化合物を分解する可能性を調べた。電子吸収スペクトルでメチルレッドのアゾの吸収を追跡した。メチルレッドのアゾの440nm付近の吸収スペクトルはNOS/NADPH/Ca^<2+>/カルモデュリンを添加することにより急速にその強度が減少した。この生成物をガスクロマトグラフィー質量分析計を用いて同定した所、メチルレッドのアゾ結合が分解してできる化合物ジメチルフェニレンヂアミンが検出された。このことより、NOSはメチルレッドのアゾ結合を分解し、その回転数は1分当たり130であると評価された。このNOSによるアゾ分解反応はNADPH,Ca^<2+>,カルモデュリンのどれが欠けても進行しなかった。又、ヘムへの阻害剤であるシアンを添加しても反応は影響されなかったが、フラビンの阻害剤であるジフェニレニアイオドニウムを添加すると反応は完全に阻害された。このことより、アゾの分解に必要な電子はNADPH還元酵素ドメインから到達することが示唆された。このことは、ヘムドメイン及び還元酵素ドメインのいくつかの変異体を用いても確かめられた。さらに、電子共鳴スピンスペクトルを用いて、メチルレッドのアゾ還元に伴って生成する窒素ラジカルを検出することが出来た。

Research Products

• [Publications] T.Shimizu,I.Sagami,: "Azo Reduction of Methyl Red by Neuronal Nitric Oxide Synthase : The Important Role of FMN in Catalysis"Biochem.Biophys.Res.Commun.. Vol.275. 752-758 (2000)
• [Publications] T.Shimizu,I.Sagami: "Azo Bond Reduction of Methyl Red with Nitric Oxide Synthase"Nitric Oxide, Biology and Chemistry. Vol.4. 212 (2000)
• [Publications] T.Shimizu,I.Sagami,: "Control of Electron Transfer in Neuronal NO Synthase"Biochem.Soc.Trans.. (印刷中). (2001)
• [Publications] T.Shimizu,I.Sagami: "The Electron Transfer Reaction of Niric-oxide Synthase"Coord.Chem.Rev.. 189(印刷中). (2001)