1998 Fiscal Year Annual Research Report
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09480154
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
大島 泰郎 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)
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| Keywords | 分断酵素 / トリプトファン合成酵素 / キメラ酵素 / 構造ユニット / ドメイン |
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| Research Abstract |
本研究計画は、酵素たんぱく質の分断化により構造の構成単位を探ることを目的としている。第一のやり方は、遺伝子的に酵素たんぱく質をコードしている遺伝子をランダムに切断し、そこに終止コドン、SD配列と開始コドンを含むオリゴヌクレオチド・カセットを挿入し、分断酵素を作成する。分断された遺伝子を大腸菌に与え、酵素活性を示す組み替え体を選抜する。この研究方法はこれまでに試みられたことのない全く新規な方法である。本年度は、昨年に試行に成功した分断方法の確立に成功した。この方法を用いて、大腸菌由来のトリプトファン合成酵素αサブユニットについて、分断を試みて、多くの分断可能な位置を検出した。分断可能な位置に関して現在、整理を勧めている。
一方、歴史的にはプロテアーゼを用いた限定分解によって分断酵素が作成されてきた。構造についてよくわかっているイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼについて、この古典的な方法による分断を試みた。特にドメイン間の相互作用が弱まっているキメラ酵素を利用して、いろいろ条件を検討した。野生型酵素に関しては、トリプシンを用いて28Kの断片を生じる条件、キメラ型酵素に関してはサーモライシンを用いて断片を生じる条件を見いだしたが、活性を持った分断化酵素を得るには至っていない。
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[Publications] Wallon, G.: "Crystal structure of Escherichia coli and Salmonella typhimurium 3-isopropylmala te dehydrogenase and comparison with their thermophilic counterpart from Thermus thermophilus." J. Mol. Biol.266. 1016-1031 (1997)
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[Publications] Akanuma, S.: "Serial increase in the thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Bacillus subtilis by experimental evolution." Protein Sci.7. 698-705 (1998)
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[Publications] Akanuma, S.: "Effect of polar side chains at position 172 on thermal stability of 3-isopropylm alate degydrogenas e from Thermus thermophilus." FEBS Lett.410. 141-144 (1997)
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[Publications] Suzuki, T.: "Screening of a mutant plasmid with high expression efficiency of GC-rich leuB ge ne of an extreme thermophile, Thermus thermophilus, in Eschericha coli." J.Biochem.121. 1031-1034 (1997)
