ヒト人工染色体構成蛋白質因子の解析と人工染色体を用いたマウス個体の形質転換

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09480185
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 舛本 寛 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 講師 (70229384)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野崎 直仁 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (70222198)
• Keywords: セントロメア / テロメア / アルフォイドDNA / 酵母人工染色体(YAC) / ヒト人工染色体 / CENP-B

Research Abstract

ヒト人工染色体構成蛋白因子の解析と人工染色体を用いたマウス個体の形質転換
ヒト21番染色体セントロメア領域から約80kbのアルフォイドDNA断片を酵母人工染色体(YAC)を用いてクローン化し、このYACをヒト培養細胞へ導入すると宿主染色対外で複製され安定に分配維持されるミニ人工染色体(MAC)が高い頻度で形成された。本研究ではこの人工染色体技術を用い、1.染色体安定維持に必須な機能領域、特にセントロメア・キネトコア、構成因子の解明、2.マウス受精卵へのMACの導入と、増殖、発生過程での導入NACの挙動と安定性の解析、等を目的として研究を進めた。
A) 人工染色体の安定維持に関わる領域に関する研究
YACに挿入されている80kbのアルフォイドDNAの断片化クローンシリーズを作成し、各断片化YACクローンDNAをHT1080細胞へ導入し人工染色体形成能を解析した結果、50kbの挿入アルフォイド配列を持つYACでは元の80kb YACと同程度の形成能が観察されたが、30kb YACでは形成効率が低下し、10kb YACではほとんど形成されなかった。安定な人工染色体形成には50kb以上のアルフォイド配列の繰り返しが必要であることが判明した。
B) セントロメア・キネトコア機能に必須な蛋白因子の解析
セントロメア・キネトコア蛋白(CENP-A,-B,-C)に対するモノクローナル抗体を作製し、細胞核抽出物を解析した結果、これら蛋白は同一の複合体に含まれることが判明した。
C) MACによるマウス個体の形質転換と安定雑持の解析
ヒト培養細胞中で人工染色体を形成したアルフォイドYAC DNAをマウス受精卵へ導入し、この受精卵を母体に戻し子マウスを多数得た。これら子マウスの尻尾DNAをPCRで解析した結果、導入YACを保持した個体(トランスジェニックマウス)を得ることに成功した。導入YACがマウス染色対外に人工染色体として維持されているかどうか現在解析中である。

Research Products

• [Publications] J.Iwahara: "A helix-turn-helix structure unit in human centromere protein B(CENP-B)." EMBOJ.17. 827-837 (1998)
• [Publications] M.Ikeno: "Construction of YAC-based mammalian artificial chromosomes." Nature Biotech.16. 431-439 (1998)
• [Publications] H.Masumoto: "Assay of centromere function using a human artificial chromosome." Chromosoma. 107. 406-416 (1998)