1997 Fiscal Year Annual Research Report
進化リアクターの構築とそれを用いた酵素の進化工学的改良
| Project/Area Number |
09555253
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
卜部 格 大阪大学, 工学部, 教授 (60029246)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
四方 哲也 大阪大学, 工学部, 助手 (00222399)
島 康文 大阪大学, 工学部, 助手 (50187423)
根来 誠司 大阪大学, 工学部, 助教授 (90156159)
|
|---|
| Keywords | 進化リアクター / グルタミン合成酵素 / ランダム変異 / DNA合成酵素 / 自己複製系 |
|---|
| Research Abstract |
本年度は、まずin vivo型進化リアクター構築のための基礎的データを得るために、グルタミン合成酵素遺伝子にランダム変異を導入し、変異型酵素遺伝子のライブラリーを作製した。作製したライブラリーからランダムに選んだ281個の変異型酵素の活性を測定し、その分布の形を明らかにするとともに、野生型酵素(GLS-W)よりも高い活性を示す変異型酵素(GLS-H)と低い活性を示す変異型酵素(GLS-L)を一つずつ選んだ。3種類の酵素を精製し、その性質を調べたところ、GLS-HはKcatが増大しており、GLS-LはKmが増大していることが.わかった。変異型酵素遺伝子の塩基配列より、GLS-HではTyr-397がHisに、GLS-LでAla-35がValにPro-94がLeuに変異していることがわかった。Tyr-397は、本酵素がアデニリル化される部位であることは興味深い。
一方、in vitro型進化リアクターの基本ユニットである自己複製系を構築するために、Thermus thermophilusのDNA合成酵素遺伝子をin vitroタンパク質合成系で翻訳し、得られた酵素を用いて元の遺伝子をPCR法で複製する条件を確立した。そして、第1世代の遺伝子から出発し、この自己複製サイクルを3回まわして第4世代の遺伝子を得ることに成功した。
|
