1997 Fiscal Year Annual Research Report

C1化合物・シアンからの有用物質生産プロセスの関係

Research Project

Project/Area Number	09556018
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	小林達彦京都大学, 農学研究科, 講師 (70221976)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小川順京都大学, 農学研究科, 助手 (70281102) 古谷祐治池田糖化工業(株), 研究室, 次長(研究職) 遠藤隆一日東化学工業(株), 中央研究所, 首席主任研究員清水昌京都大学, 農学研究科, 教授 (70093250)
Keywords	シアン / C1化合物 / β-シアノアラニン合成酵素 / Pseudomonas ovalis / β-シアノアラニン / PLP
Research Abstract	Pseudomonas ovalisから(シアンとアミノ酸が縮合し)ニトリルを合成する酵素(β-シアノアラニン合成酵素)の精製標品のN末端及び内部アミノ酸配列の情報をもとに作製したプライマーを用いて、本菌の染色体DNAに対しPCR反応を行った。本PCR反応により増幅したDNA断片(約700bp)をプローブとして、新たに染色体DNAに対してサザンハイブリダイゼーションを行い、約3kbのDNA断片を取得したが、目的の遺伝子の全長を含まないことが判明した。そこで、得られた約3kb中の構造遺伝子の領域(約680bp)を新たにプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、全長を含む約2kbのDNA断片を取得した。本DNA断片をpBluescriptに挿入し、全塩基配列を決定した結果、本酵素は323アミノ酸から成り、分子量34,263であることが推定された。次に、大腸菌におけるβ-シアノアラニン合成酵素の大量発現の実験を行った。本酵素構造遺伝子の塩基配列をもとにプライマーをデザインしてPCR反応を行い、増幅したDNA断片をpUC18に挿入したプラスミドを構築し、大腸菌での発現を検討した。その結果、多量のβ-シアノアラニン合成酵素が発現し、最適条件下では可溶性タンパク質の約40%を占めるに至った。本酵素を精製し、吸収スペクトルを測定した結果、典型的なPLP酵素であることが判明した。従って、補酵素PLPの結合部位の決定を試みた結果、本酵素の43Lysine残基にPLPが結合していることが明らかになった。さらに、ニトリラーゼとβ-シアノアラニン合成酵素を組み合わせたシアンからのアミノ酸合成実験を行った。

Research Products
(8 results)

All Other

All Publications (8 results)

[Publications] M.Kobayashi et al.: "Characterization and distribution of IS1164 that exists in the high molecular mass nitrile hydratase gene cluster." Proc.Japan Acad.73B(6). 104-108 (1997)
[Publications] M.Kobayashi et al.: "Identification of active sites in amidase : Evolutionary relationship between amide bon-and peptide bond-cleaving enzymes." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 94(22). 11986-11991 (1997)
[Publications] H.Komeda et al.: "A novel transporter in cobalt uptake." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 94(1). 36-41 (1997)
[Publications] 小林達彦: "重金属コバルトによるスーパー酵素の誘導" バイオサイエンスとインダストリー. 55(3). 208-209 (1997)
[Publications] 小林達彦: "ニトリル変換酵素の物質生産への機能開発" 農化誌. 71(12). 1243-1252 (1997)
[Publications] 小林達彦: "Rhodococcusのニトリルヒドラターゼとトランスポーター" 日本応用酵素協会誌. 32. 1-7 (1997)
[Publications] S.Shimizu et al.: "Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,vol.58" Springer-Verlag,Berlin, 42 (1997)
[Publications] 清水昌: "高純度化技術大系.第3巻" フジ・テクノシステム,東京, 11 (1997)

1997 Fiscal Year Annual Research Report

C1化合物・シアンからの有用物質生産プロセスの関係

Principal Investigator

小林 達彦 京都大学, 農学研究科, 講師 (70221976)

Research Products

[Publications] M.Kobayashi et al.: "Characterization and distribution of IS1164 that exists in the high molecular mass nitrile hydratase gene cluster." Proc.Japan Acad.73B(6). 104-108 (1997)

[Publications] M.Kobayashi et al.: "Identification of active sites in amidase : Evolutionary relationship between amide bon-and peptide bond-cleaving enzymes." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 94(22). 11986-11991 (1997)

[Publications] H.Komeda et al.: "A novel transporter in cobalt uptake." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 94(1). 36-41 (1997)

[Publications] 小林 達彦: "重金属コバルトによるスーパー酵素の誘導" バイオサイエンスとインダストリー. 55(3). 208-209 (1997)

[Publications] 小林 達彦: "ニトリル変換酵素の物質生産への機能開発" 農化誌. 71(12). 1243-1252 (1997)

[Publications] 小林 達彦: "Rhodococcusのニトリルヒドラターゼとトランスポーター" 日本応用酵素協会誌. 32. 1-7 (1997)

[Publications] S.Shimizu et al.: "Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,vol.58" Springer-Verlag,Berlin, 42 (1997)

[Publications] 清水 昌: "高純度化技術大系.第3巻" フジ・テクノシステム,東京, 11 (1997)

小林達彦京都大学, 農学研究科, 講師 (70221976)

[Publications] 小林達彦: "重金属コバルトによるスーパー酵素の誘導" バイオサイエンスとインダストリー. 55(3). 208-209 (1997)

[Publications] 小林達彦: "ニトリル変換酵素の物質生産への機能開発" 農化誌. 71(12). 1243-1252 (1997)

[Publications] 小林達彦: "Rhodococcusのニトリルヒドラターゼとトランスポーター" 日本応用酵素協会誌. 32. 1-7 (1997)

[Publications] 清水昌: "高純度化技術大系.第3巻" フジ・テクノシステム,東京, 11 (1997)