Cl化合物・シアンからの有用物質生産プロセスの開発

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09556018
• Research Institution: KYOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 小川 順 京都大学, 農学研究科, 助手 (70281102)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古谷 裕治 池田糖化工業(株), 研究室, 次長(研究職) ; 遠藤 隆一 日東化学工業(株), 中央研究所, 首席主任研究員 ; 清水 昌 京都大学, 農学研究科, 教授 (70093250)
• Keywords: シアン / Cl化合物 / ニトリルヒドラターゼ / β-シアノアラニン合成酵素 / β-シアノアラニン

Research Abstract

本年度は、ニトリルヒドラターゼとβ-シアノアラニン合成酵素を組み合わせたシアンからのアミノ酸合成実験を行った。すなわち、放線菌Rhodococcus rhodochrous J1の(ニトリルをアミドに変換する酵素)ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの下流にニトリルヒドラターゼとPscudomonasのβ-シアノアラニン合成酵素の遺伝子を連結した発現プラスミドを構築し、Rhodococcus rhodochrous ATCC12674で発現させた。得られた形質転換体の無細胞抽出液をSDS/PAGEで解析した結果、(αとβのヘテロなサブユニットから構成される)ニトリルヒドラターゼとともに、β-シアノアラニン合成酵素が可溶性タンパク質として、大量に発現することを認めた。続いて、得られた形質転換体の無細胞抽出液をシアンとO-アセチル-L-セリンを含む系に添加し反応の経過を追ったところ、速やかにシアンからβ-シアノアラニンが生成し、続いて、最終生成物であるアスパラギンの生成が認められた。
一方、β-シアノアラニン合成酵素遺伝子だけを導入した大腸菌形質転換体が本酵素を大量に生成することを認めた。本無細胞抽出液から精製した本酵素と、(別にRhodococcus rhodochrous J1から精製した)ニトリルヒドラターゼをともに使用して実験を行ったところ、シアンとO-アセチル-L-セリンからβ-シアノアラニンが生成し、その後、比較的収率よくアスパラギンヘ変換された。このように、C1化合物であるシアンを利用して有用なアミノ酸を合成できる系を確立した。

Research Products

• [Publications] Kobayashi,M. & Shimizu,S.: "Metalloenzyme nitrile hydratase : Structure,regulation,and application to biotechnology" Nature Biotechnol.16. 733-736 (1998)
• [Publications] Kobayashi,M.et al.: "The catalytic mechanism of amidase also involves nitrile hydrolysis" FEBS Lett.439. 325-328 (1998)
• [Publications] Kobayashi,M.et al.: "Nitrilase catalyzes amide hydrolysis as well as nitrile hydrolysis" Biochem.Biophys.Res.Commun.253. 662-666 (1998)
• [Publications] Kobayashi,M.et al.: "Lactone-ring-cleaving enzyme : Genetic analysis,novel RNA editing,and evolutionary implications" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 95. 12787-12792 (1998)