遺伝子解析によるCampylobacter属菌の検出,同定,株間識別法の開発

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09556069
• Research Institution: Azabu University
• Principal Investigator: 金内 長司 麻布大学, 獣医学部, 教授 (20087597)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中馬 猛久 鹿児島大学, 農学部, 助手 (90201631) ; 木内 明男 麻布大学, 獣医学部, 助教授 (60120953) ; 福山 正文 麻布大学, 環境保健学部, 教授 (40075932) ; 伊藤 喜久次 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (50100045) ; 松田 基夫 麻布大学, 環境保健学部, 教授 (50139531)
• Keywords: 株間識別 / カンピロバクター / 検出 / 同定 / PCR / パルスフィールドゲル電気泳動 / 16SrDNA配列 / ニワトリ

Research Abstract

Campylobacter lariおよびウレアーゼ陽性好温性Campylobacter(UPTC)の株間識別におけるパルスフィールド電気泳動(PFGE)法およびflagellin遺伝子に着目したPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)による解析法の有効性について検討したところ、制限酵素ApaI,SmaIおよびSalIを用いたPFGE法はC.lariとUPTCの株間識別に有効であること、C.Jejuniから作成されたflagellin遺伝子に対するプライマーはUPTC株から調整されたゲノムDNAを鋳型とした場合、想定される断片が増幅されることが明らかになった。
PCR法とsouthern blot hybridization(SBH)法を用いて鶏糞便中のC.jejuniを検出したところ、C.jejuniを混入させた鶏糞便中からは、PCR法では34,000個、SBH法では340個の菌を検出することができた。SBH法により3週齢までのひな盲腸内容物中の数例でC.jejuniが検出されたが、PCR法では全く検出されなかった。18日齢の胚の盲腸内容物51例中2例がPCR法とSBH法でC.jejuni陽性であった。しかし、通常の増菌法による培養ではC.jejuniは分離されなかった。
C.jejuni,C.coli,C.lari,およびC.upsaliensisの参照株について、16SrDNA配列を明らかにする目的で,約750bpを生ずるプライマーセット1組と全長を増幅する2組のプライマーセットを使用し、PCRでの増幅を試みた。前者のプライマーではC.jejuni,C.lari,C.upsaliensisは増幅されたが、C.coliは増幅されなかった。また、後者では、C.jejuniおよびC.upsaliensisのみがそれぞれのプライマーセットで増幅された。こられのことから、Campylobacterの16SrDNA配列の3'末端は菌種によって違いがあることが推察された。

Research Products

• [Publications] Matsuda,M.: "First finding of urease-Positive thermophilic strains of Campylobaeter in river water in the Far East,namely in Japan-" J.Appl.Bacteriol.81. 608-612 (1996)
• [Publications] Chuma,T: "Direct detection of Campylobacter jejuni in chicken cecal contents by PCR" J.Vet.Med.Sci.59(1). 85-87 (1997)