共焦点顕微鏡法とミクロインジェクションを組合せた組織細胞解析法の展開

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09557002
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 高田 邦昭 群馬大学, 医学部, 教授 (20129290)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 健史 群馬大学, 生体調節研究所, 助手 (00261868)
• Keywords: 糖輸送体 / GLUT4 / 免疫組織化学 / トランスロケーション / 脂肪細胞 / 共焦点顕鏡鏡 / タイムラプス観察

Research Abstract

インスリン刺激時における脂肪細胞の糖輸送能上昇は,膜蛋白質である糖輸送体GLUT4を有する細胞質中の小胞が細胞膜に融合し,細胞表面の糖輸送体数を増加させることによっておこっている(糖輸送体のトランスロケーションモデル).この過程を詳細に検討するためにグリーンフルオレッセントプロテイン(GFP)標識法を適用し,生きた細胞でのタイムラプス観察を試みた.まずGFPとGLUT4との融合蛋白の各種コンストラストを作製し,Cos7細胞に導入発現させ,核周囲部に局在するものを選択した.これを3T3-L1線継芽細胞に導入したあと,脂肪細胞へと誘導分化させた.GLUT4のC末に対する抗体は内在性GLUT4の他にも今回用いたGFP-GLUT4も認識した.GFP-GLUT4発現細胞で,GFPシグナルと抗GLUT4抗体によるシグナルを比較検討したところ,GFPシグナルの強い部位で相対的にGLUT4抗体によるシグナルの弱くなるという,抗体のアクセシビリティーに起因すると思われる傾向はあったが,基本的な局在は同一であった.そこでGFP-GLUT4を発現した3T3-L1脂肪細胞をカバースリップ上に培養し,正立顕微鏡下にセットしインスリン刺激時における動態のタイムラプス観察をおこなった.GFP-GLUT4の細胞膜への移行が観察されたが,大部分のものは細胞質中に残っているように見えた.

Research Products

• [Publications] Omata W: "Actin filaments play a critica1 role in insulin-induced exocytotic recruitment but not in endocytosis of GLUT4 in isolated rat adipocytes."Biochem J. 346. 321-328 (2000)
• [Publications] Sugawara-Yokoo M: "Differential localization of organic cation transporters rOCT1 and r0CT2 in the basolateral membrane of rat kidney tubules."Histochem Cell Biol. 114. 175-180 (2000)
• [Publications] Matsuzaki T: "An anti-peptide antibody that recognized unexpected protein-A case report."Acta Histochem Cytochem. 33. 361-365 (2000)
• [Publications] Suzuki T: "Polarized distribution of Na^+ -dependent glucose cotransporter SGLT1 in epithelial cells."Acta Histochem Cytochem. 33. 159-162 (2000)
• [Publications] 高田邦昭: "遺伝子工学を用いた形質膜の機能解析"組織培養工学. 26. 170-171 (2000)