新規白血病治療薬としてのトキシン縮合顆粒球コロニー刺激因子の開発に関する研究

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09557082
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 東條 有伸 東京大学, 医科学研究所, 講師 (00211681)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浅野 茂隆 東京大学, 医科学研究所, 教授 (50134614)
• Keywords: 顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF) / 緑膿菌外毒素(PE) / 白血病

Research Abstract

われわれは遺伝子組み換え技術を用いて、顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte colony-stimulatingfactor; G-CSF)のカルボキシル末端に細胞膜結合領域を欠失した緑膿菌外毒素(40 kD fragment ofPseudomonas exotoxin;PE40)を融合させたキメラトキシン(G-CSF-PE40)を大腸菌で産生させ、G-CSF受容体選択的な細胞毒性を示す生理活性物質として精製することに成功した。しかしながら、われわれが用いた大腸菌BL21(λDE3)株とpET発現ベクターの組み合わせではせいぜい1〜2μg/L程度のキメラトキシンしか回収できず、研究室レベルの培養で動物実験に必要な量を調整することは不可能であった。そこで、G-CSFcDNAの上流に大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列を挿入したところ、産生量が数十倍に増加した。また同時に、大部分のキメラトキシンは可溶性分画に回収できたのでカラム操作の前にrefoldingを行う必要がなくなった。こうして得られた精製G-CSF ト-PE40を正常BDF_1マウスへ3日間連続投与したところ、投与終了後2日目をピークとして一過性の高度な好中球減少症が観察されたが、約7日目には元のレベルに回復した。次に、SJL/Jマウス由来の放射線誘発性急性骨髄性白血病(AML)細胞L103を同系マウスへ静注し、白血病死させる実験においてキメラトキシンの効果を検討した。L103静注後の平均生存期間でみると、コントロール群(3匹)の17日に比較して100ng/bodyのG-CSF-PE40を投与した群(4匹)では30日と有意に延長していた。このキメラトキシンの毒性は標的細胞上のG-CSF受容体の発現レベルに依存することから、正常マウスでは比較的発現レベルの高い好中球優位に効果を発揮し、一方G-CSF感受性の高いし103細胞の移植実験においては白血病発症までの期間を延長したものと考えられた。
いっぽう、ヒトIL3のN末端側に酵素活性を有する25kDのPEドメインIIIを融合させたIL3トキシン(PE25-IL3)を作製した。このキメラトキシンのC末端には細胞質局在シグナルであるKDEL配列を置いた。IL3は分子内にS-S結合を1対しか持たず、またPEドメインIIIにはCysがないため、このIL3トキシンは大腸菌において可溶性の活性蛋白質として産生させることが可能であり、G-CSFトキシンのように変性・リフォールディングが不要である。生物活性は現在検討中であるが、IL3も血球選択性の高いサイトカインであり、白血病治療への応用を検討したい。

Research Products

• [Publications] Oshima Y,Tojo A,Niho Y,Asano S: "Cytotoxic activity of a human granulocyte colony-stimulating factor-Pseudsmouns Exotoxin fusion protein on murine mysloid lcukemia cells" Cancer Research. (in press).