臨床応用に向けた長期凍結保存可能なバイオ型人工肝臓の開発研究

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09557093
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 松下 通明 北海道大学, 医学部・附属病院, 講師 (20250425)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤堂 省 北海道大学, 医学部, 教授 (60136463) ; 丸藤 哲 北海道大学, 医学部・附属病院, 講師 (30125306) ; 村林 俊 北海道大学, 工学部, 助教授 (30200306)
• Keywords: ハイブリッド型人工肝 / スフェロイド / 回旋培養 / 冷凍保存

Research Abstract

大量の肝細胞を充填した人工肝の開発を目的として今年度は以下の実験を行った。
1. 迅速肝細胞スフェロイド作成法の検討
ハイブリッド型人工肝臓モジュールの機能中心として肝細胞スフェロイドの迅速大量作成を目的に、スフェロイド作成実験を行った。EGTA,Ca2+無添加灌流分離法によって得られた肝細胞を旋回培養すると6時間後には約80%の肝細胞がスフェロイドを形成することが判明した。
2. 冷凍保存法の研究
a. 装置化材料の基礎研究
1) モジュール筐体の耐凍結性についての検討
ポリカーボネート樹脂(PC)、スチレン・ブタジエンブロック共重合体樹脂(AFX)、アクリロニトリル・スチレン共重合体樹脂(AS)について凍結保存・急速解凍を行い、容器漏洩試験を行った。AFXには変形・漏洩を認め、ASは破損したがPCには損傷を認めなかった。筐体の素材にはPCが適していると考えられる。
2) 膜素材の耐凍結性についての検討
ポリエチレン、セルロースジアセテート、ポリアクリロニトリルの3膜素材について凍結保存実験を行ない解凍後の中空糸リーク試験にて評価した。ポリエチレン膜のみがリークを認めなかったが、今後他の素材、肝細胞との親和性についても検討を行い最適な素材の選定を行う予定である。
b. 肝細胞スフェロイドの凍結条件の検討
上記方法にて作成した肝スフェロイドを凍結保存するための至適凍結条件(DMSO濃度、冷却条件)を解凍後の尿素合成能を経時的に測定し検討した。10%DMSO,10%FCS添加L-15培地に浮遊させた肝細胞スフェロイドを-5.5℃にてsuper coolingし、1℃/minにて-40℃まで冷却、-80℃の冷凍庫に保存(1-5日)し、37℃にて急速解凍したものが解凍後の尿素合成能が最も保たれていた。尿素合成能(μg/時/DNA)は解凍直後,3,6,9,12,24,48時間後において、3.71,2.03,1.70,1.54,1.40,1.11,1.90であり、解凍6時間後以降はほぼ尿素合成能は保たれていた。また、非凍結スフェロイドに比較し、解凍直後で約70%,48時間後でも約66.7%の機能を維持していた。今後、アルブミン産生能、P450機能を測定する予定である。

Research Products

• [Publications] 松下 通明: "人工肝臓-この1年の進歩" 人工臓器. 27. 804-805 (1998)
• [Publications] 松下 通明: "バイオ人工肝臓" 組織培養工学. 24・5. 188 (1998)
• [Publications] Hiromitsu Noto: "Effect of High Concentrations of Bile Acids on Cultured Hepatocytes" Artificial Organs. 22(4). 300-307 (1998)
• [Publications] 大久保 尚: "ハイブリッド型人工肝作製を目指した至適大量肝細胞単離法の検討" 日本外科学会雑誌. 100. 558 (1999)