1999 Fiscal Year Annual Research Report

進化的手法によるPCR用耐熱ポリメラーゼの創製

Research Project

Project/Area Number	09558081
Research Institution	Tokyo University of Pharmacy & Life Science
Principal Investigator	大島泰郎東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)
Keywords	イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / RNAポリメラーゼ / Taqポリメラーゼ / 進化分子工学 / 低温適応
Research Abstract	遺伝子工学手法を用いて実験室内進化の系を考案し、モデル酵素タンパク質、さらに平行して最終目的であるDNA関連酵素を改変し、高活性でかつ耐熱性の酵素を創製することを目的に、高度好熱性細菌の酵素を常温適応させること、逆に常温酵素を進化的に耐熱化することを試みた。すでに昨年成功したように、高度好熱菌Thermus thermophilusのイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをモデル酵素として常温に適応させると、ある場合には高い耐熱性を維持したまま、常温での活性が著しく改善できることが分かった。今年度はさらに多くの高活性、高安定な変異体の分種に成功した。その機構を探るために、タンパク質工学的な研究を展開した。すなわち、得られた変異体の変異部位を他のアミノ酸残基に置換し、側鎖の置換の効果を解析した。同様な手法を用いて、RNAポリメーラーゼの改良を試みている。目的遺伝子を高度好熱菌の主染色体に組み込み、RNAポリメラーザ用のプロモーターの下にマーカー遺伝子をつなぐ系を試みているが、その改良として同一プラスミド上に両者を乗せる系を開発した。現在も探索中である。同様にPCRに用いられているTaqポリメラーゼの改良も試みている。同酵素をコードする遺伝子を保持する大腸菌用いてランダムライブラリーを作りの分断し、その中から特定の活性を保持している変異体をスクリーニングしている。今なお、条件を検討中である。

Research Products
(5 results)

All Other

All Publications (5 results)

[Publications] A.CHIBA et al.: "Coenzyme Activity of NAD Analogs for 3-Isopropylmalate Dehydrogenase from Thermus thermophilus HB8"Biosci.Biotechnol. Biochem.. 63(9). 1647-1649 (1999)
[Publications] J.Nathaniel et al.: "Structural Conservation of the Isolated Zinc Site in Archaeal Zinc-containing Ferredoxins as Revealed by X-ray Absorption Spectroscopic Analysis and Its Evolutionary Im;lications"J.Biol.Chem. 274(33). 23160-23168 (1999)
[Publications] A.CHIBA et al.: "Synthetic and Mechanistic Studies of (2R,3S)-3-Vinylmalic Acid as a Mechanism-Based Inhibitor of 3-Isopropylmalate Dehydrogenase"J.Org.Chem. 64(17). 6159-6165 (1999)
[Publications] S.AKANUMA et al.: "Further Improvement of the Thermal Stability of a Partially Stabilized Bacillus subtilis 3-Isopropylmalate Dehydrogenase Variant by Random and Site-Directed"Eur.J.Biochem. 260. 499-504 (1999)
[Publications] C.MOTONO et al.: "Urea-Induced Unfolding and Conformational Stability of 3N-Isopropylmalate Dehydrogenase from the Thermophile Thermus thermophilus and Its Mesophilic counterpart from escherichaia coli"Biochemistry. 38{4}. 1332-1337 (1999)

1999 Fiscal Year Annual Research Report

進化的手法によるPCR用耐熱ポリメラーゼの創製

Principal Investigator

大島 泰郎 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)

Research Products

[Publications] A.CHIBA et al.: "Coenzyme Activity of NAD Analogs for 3-Isopropylmalate Dehydrogenase from Thermus thermophilus HB8"Biosci.Biotechnol. Biochem.. 63(9). 1647-1649 (1999)

[Publications] J.Nathaniel et al.: "Structural Conservation of the Isolated Zinc Site in Archaeal Zinc-containing Ferredoxins as Revealed by X-ray Absorption Spectroscopic Analysis and Its Evolutionary Im;lications"J.Biol.Chem. 274(33). 23160-23168 (1999)

[Publications] A.CHIBA et al.: "Synthetic and Mechanistic Studies of (2R,3S)-3-Vinylmalic Acid as a Mechanism-Based Inhibitor of 3-Isopropylmalate Dehydrogenase"J.Org.Chem. 64(17). 6159-6165 (1999)

[Publications] S.AKANUMA et al.: "Further Improvement of the Thermal Stability of a Partially Stabilized Bacillus subtilis 3-Isopropylmalate Dehydrogenase Variant by Random and Site-Directed"Eur.J.Biochem. 260. 499-504 (1999)

[Publications] C.MOTONO et al.: "Urea-Induced Unfolding and Conformational Stability of 3N-Isopropylmalate Dehydrogenase from the Thermophile Thermus thermophilus and Its Mesophilic counterpart from escherichaia coli"Biochemistry. 38{4}. 1332-1337 (1999)

大島泰郎東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)