制限修飾遺伝子の自己維持機能を利用したプラスミド安定化

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09558085
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 小林 一三 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (30126057)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川上 文清 東洋紡績株式会社, 敦賀バイオ研究所, 首席部員
• Keywords: 制限酵素 / メチル化酵素 / プラスミド / 相同組換え / 大腸菌 / バクテリオファージ / 減数分裂 / 性

Research Abstract

1)宿主遺伝子型の影響。
不和合なプラスミドによる追い出しへの、内在制限修飾プラスミドの抵抗を定量化した。制限修飾遺伝子を持つプラスミドを温度感受性複製単位でドライブし、温度シフトによって複製を止める系を作った。これらの系で、大腸菌のrec遺伝子型が、大きな影響を与えることを見いだした。プロテアーゼ欠損変異では影響が見られなかった。
2)細胞の応答の追跡。
細胞の増殖が鈍くなり、細胞が多核フィラメントになり、染色体の切断、分解が進んだ。recBC変異株では、増殖の阻害が著しく、フィラメント中の核が消失していった。切断された染色体が蓄積し、それらはさらに分解した。lacZレポーターによって、SOS応答の誘発が示された。
:3)染色体上の制限修飾系遺伝子の安定化。
染色体上にあるPaeR7制限修飾遺伝子形質導入での相同な遺伝子による置き換えに対して、宿主殺しによって抵抗すること、これが宿主の相同組換え経路によって影響されることを示した。まれなtransductantのうちには、ドナーとレシピエントの双方の形質を持つものがあった。これらの多くでは、パルスフイールドゲル電気泳動で大規模な染色体再編が検出できた。制限修飾遺伝子を含む大きな領域が、それを狭む順向き反復配列間の不等交叉によって重複し、そのうち一つの制限修飾遺伝子だけがドナーとの相同組み換えによって置き換えられるたと考えられる。このことは、「分離後宿主殺し」による自己安定化が、制限修飾系遺伝子自身の性質であることを意味する。これは、プラスミド上の遺伝子だけでなくて、染色体上の遺伝子も制限修飾遺伝子を連結することによって安定化できる可能性を示している。
4)制限修飾酵素の追跡の準備。
修飾酵素の活性の測定条件を検討中である。抗体作成のために、EcoRI制限酵素と修飾酵素の大量発現を行った。

Research Products

• [Publications] Handa,N.: "χ^*,χ-related 11-mer partially active in an E.coli recχ^* strain." Genes to Cells. 2(8). 525-536 (1997)
• [Publications] Kusano,K.: "A new type of illegitimate recombination is dependent on restriction and homologous interaction." J.Bacteriol.179(17). 5380-5390 (1997)
• [Publications] Handa,N.: "Clustering of c sequence in Escherichia coli genome." Microb.Comp.Genomics. 2(4). 287-298 (1997)
• [Publications] Kobayashi,I.: "Homologous recombination for human gene therapy." Proceedings of the third worldwide internet conference "Molecular and Cellular Biology of Gene Therapy". CD-ROM publication. (1997)
• [Publications] Takahashi-Kobayashi,K.: "Genetic Recombination through Double-strand Break Repair:Shift from Two-progeny Mode to One-progeny Mode Heterologous Inserts." Genetics. 146. 9-26 (1997)
• [Publications] Naito,Y.: "Selfish restriction modification genes:Resistance of a resident RM plasmid to displacement by an incompatible plasmid mediated by host killing." Biol.Chem.(in press).
• [Publications] Fujitani,Y.: "Mismatch-stimulated destruction of intermediates as an explanation for map expantion in genetic recombination." J.Theor.Biol.(in press).
• [Publications] 半田直史: "「利己的な遺伝子」にプログラムされる死." 遺伝. 52. 61-67 (1998)
• [Publications] 半田直史: "死をプログラムする利己的遺伝子." 最新医学. 52. 67-74 (1997)
• [Publications] 半田直史: "死をプログラムする細菌の遺伝子." Bioclinica.12. 352-355 (1997)
• [Publications] 半田直史: "相同組換えの機序と遺伝子治療への応用." 治療学. 31. 21-24 (1997)
• [Publications] Kazumi Yamamoto: "Serratia liquefaciens as a new host superior for overproduction and purification using N-acetylneuraminate lyase gene of Escherichia coli" Analytical Biochemistry. 246. 171-175 (1997)
• [Publications] Masahiro Takagi: "Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp.strain KODI and its application to PCR" Applied and Environmental Microbiology. 4504-4510 (1997)
• [Publications] 杉山明生: "PCRを用いたテロメラーゼ活性測定法" 細胞工学. 16. 1043-1051 (1997)
• [Publications] 川上文清: "RACE PCRを用いた完全長cDNAクローニング法" 細胞工学. 16. 469-477 (1997)
• [Publications] 川上文清: "α型DNAポリメラーゼを用いたPCR" 細胞工学. 16. 725-732 (1997)
• [Publications] 川上文清: "PCR-CFLP" 細胞工学. 16. 1043-1051 (1997)
• [Publications] Kusano-Fujita,A.: "Gene Therapy Vector Protocols Handbook.In:Kmiec,E.B.,ed." Humana Press,Totowa,NJ,USA(in press),
• [Publications] 内藤泰宏: "遺伝子治療開発研究ハンドブック・相同組換え法による遺伝子導入." エヌ・ティー・エス(刊行中),