プロテインホスファターゼ2Aの特異的阻害ペプチドの開発と培養細胞への導入

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09558086
• Research Institution: HIROSHIMA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 武田 誠郎 広島大学, 医学部, 教授 (40030853)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西藤 泰昌 広島大学, 医学部, 助手 (40284187) ; 田邊 修 広島大学, 医学部, 講師 (70221398) ; 碓井 裕史 広島大学, 医学部, 助教授 (40127618)
• Keywords: タンパク質リン酸化 / プロテインホスファターゼ2A / セリン / トレオニンホスファターゼ / 調節サブユニット / 74kDaB"サブユニット / B"結合タンパク質 / 阻害ペプチド / ヒト赤血球

Research Abstract

1. B"サブユニットのスプライス変異体の同定-ヒトの大脳皮質より,B"サブユニットのスプライスバリアントをコードする2種のcDNAを単離した。これらはN末端付近の32個または106個のアミノ酸残基からなる領域を欠失していた。これらのcDNAをpGEXベクターに組み込んで大腸菌に導入し,B"サブユニットのスプライスバリアントとGSTとの融合蛋白を発現させた。今後さらにB"サブユニットの他の領域を欠失させた変異体もGST融合蛋白として作成し,これらとPP2AのAC二量体との結合能を調べ,結合に関わる領域を同定する。また,これらのGST融合蛋白のACの酵素活性におよぼす影響を検討し,活性阻害に関わるB"の領域を決定する。これらの領域のアミノ酸配列にもとづいてPP2Aの阻害ペプチドをデザインする。
2. AキナーゼによるB"サブユニットのリン酸化とB"ACの活性化-B"ACは試験管内でAキナーゼによりB"のSer-60,Ser-75,Ser-573がリン酸化され,B"ACのH1およびH2Bヒストンに対するホスファターゼ活性が促進された。したがって,これらのリン酸化部位の周辺の構造がB"によるACの活性阻害に関与している可能性がある。これらの領域のアミノ酸配列に基づいてPP2Aの活性を阻害するペプチドのデザインを試みる。
3. 酵母Two-Hybrid法を用いたB"結合蛋白の同定-B"ACの三量体PP2Aの活性や細胞内局在を制御する蛋白を同定する目的で,酵母Two-Hybrid法を用いてヒトB"に結合する蛋白を探索した。まず,GAL4転写活性化ドメインとの融合蛋白を発現するヒト大脳cDNAライブラリーを調製した。つぎに,転写因子GAL4のDNA結合ドメインとヒトB"との融合蛋白を発現する出芽酵母株を作成した。この株にライブラリーDNAを導入し,リポーターであるHIS3遺伝子の発現を指標にしてスクリーニングした。これまでに120万個のクローンのスクリーニングにより78個の陽性クローンが得られている。今後,B"とこれらのcDNAにコードされる蛋白との結合に関わる領域を決定する。これらの領域のアミノ酸配列にもとづいてB"ACの三量体PP2Aの機能を阻害するペプチドのデザインを試みる。

Research Products

• [Publications] Hirofumi Usui: "Activation of protein phosphatase 2A by cAMP-dependent protein kinase-catalyzed phosphorylation of the 74-kDa B"(δ)regulatory subunit in vitro and identification of the phosphorylation sites" FEBS Letters. 430. 312-316 (1998)
• [Publications] 武田 誠郎: "プロテインホスファターゼ研究の現状と展望" 蛋白質 核酸 酵素. 43・8. 927-934 (1998)
• [Publications] 碓井 裕史: "プロテインホスファターゼ2Aの構造と活性制御機構" 蛋白質 核酸 酵素. 43・8. 945-951 (1998)
• [Publications] 田邊 修: "細胞機能におけるプロテインホスファターゼ2Aの意義" 蛋白質 核酸 酵素. 43・8. 1013-1020 (1998)
• [Publications] Yasumasa Nishito: "Direct metal analyses of Mn^<2+>-dependent and independent protein phosphatase 2A from hunan erythrocytes detect zinc and iron only only in Mn^<2+>-independent one." FEBS Letters. (in press). (1999)