無脊椎動物(カブトガニ)の生体防御系を利用した感染菌の高感度検出法・除去法の開発

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09558087
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 牟田 達史 九州大学, 医学部, 助教授 (60222337)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 重則 生化学工業, 開発企画部, 診断薬室長(研究職) ; 川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助教授 (90183037)
• Keywords: プロテアーゼ / 異物認識 / 体液凝固 / β-ブルカン / カブトガニ / 真菌 / 前駆体 / 生体防御

Research Abstract

我々が、カブトガニ血球細胞より発見、精製したβ-グルカン感受性プロテアーゼ前駆体Factor Gは二つのサブユニットが非共有結合で会合したヘテロダイマーのタンパク質であり、37kDaのサブユニットβがセリンプロテアーゼ前駆体の構造をもつのに対し、72kDaのサブユニットαは細菌や植物由来のタンパク質に相同性をもつ三種のドメイン構造よりなるモザイクタンパク質である。我々は、Factor Gのβ-グルカン認識部位を同定するとともに、定量的な解析を行うため、各ドメインをglutathione S-transferase融合タンパク質として大腸菌内で発現し、精製した。発現したタンパク質より、glutathioneS-transferase部分を除去した後、β-グルカン、マンナン、キシランを固定化したゲルと混合し、各多糖との結合をみたところ、サブユニットαのC末端に存在するxylanase Z様の2回繰り返しドメインが、β-グルカンに特異的に結合することが明らかになった。ビオチン化したβ-グルカンをセンサーチップ上に固定化し、BIAcoreを用いてその結合定数を測定したところ、Ka=8.03×10^8M^<-1>という高い親和性が確認された。さらに、Factor Gの活性化能のない短鎖β-グルカンも、このドメインに結合することが判明した。また、このドメインは、Factor Gのβ-グルカンによる活性化を拮抗的に阻害することが示された。さらに、このドメインは、二つの繰り返し構造よりなるが、それぞれ単独で発現しても、長鎖β-グルカンとの結合は保持されていた。すなわち、Factor GはC末端に二つのβ-グルカン結合部位をもち、それぞれが、(1,3)-β-glucoside結合を認識して、活性化を惹起していることが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Iwanaga,S.: "New Types of Clotting Factors and Defense Molecules Found in Horseshoe Crad Hemolymph:Their Structures and Functions." Journal of Biochemistry. 123,(1). 1-15 (1998)
• [Publications] Nanbo,A.: "Lipopolysaccharide stimulates HepG2 human hepatoma cells in the pressence of lipopolysaccharide-binding protein via CD14" European Journal of Biochemistry. 発表予定.