細胞内への巨大分子導入法の確立と、シナプス伝達機構解析への応用

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09558103
• Research Institution: KYOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 大森 治紀 京都大学, 大学院・医学研究科, 教授 (30126015)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古谷野 好 京都大学, 大学院・医学研究科, 講師 (50183041)
• Keywords: 神経回路 / Electro poration / シナプス / 分子量 / 巨大分子 / 電圧パルス

Research Abstract

神経回路の機能を脳切片標本を用いて解析するに際して、大きな問題の一つは、神経細胞間のシナプス結合が多くの場合切れており標的となるシナプス結合を探ることに多くの時間を費やさざるを得ないことである。こうした問題の一つの解決法として神経細胞を染色し軸索の伸展を例えば蛍光画像として観察でき、その軸索方向に沿った刺激を与える事ができれば、非常に高い確率で対応するシナプス後細胞を特定でき、実験の効率を飛躍的に向上できると考えられる。われわれは当初、特定の神経細胞に巨大分子を導入する手段としてmicro-electroporation法を考案し開発を始めた。しかし、神経細胞の脆弱性を始めとして、さまざまな困難があり、当初の計画は断念せざるを得なかった。しかし、3k-10k程度の分子量の分子までは電圧パルスによって安定して神経細胞に導入することができ、しかも神経細胞は導入後数時間から最大翌日まで生き延びることが確認できた。しかし、一方では前もって神経細胞内に充填したfura-2などの分子量1k程度の蛍光色素はmicro-electroporationの電圧パルスによって消失することも解り、電圧パルスは細胞膜にかなり大きな穴を開け細胞膜内外での物質の流れをおそらく濃度勾配によって引き起こしていることも明らかになった。電圧パルスによって流出する細胞内成分は多数に上ると見られ、micro-electroporationを実験使用する際に、注意を要することである。こうした流失した物質がどの程度の時間経過で再生されるかは興味のあるところであるが、今回この時間経過を明らかにするには至らなかった。

Research Products

• [Publications] Ishii MT.et al.: "Moleculer charactenzation of the hyperpolarization-activated cation chonnel in rabbit heart sinoatrial nodc"J. Biol. Chem.. 274. 12835-12839 (1999)
• [Publications] Okada T.,King Y.& Ohmori H.: "Li^+ ind muscarine cooperatively enhance the cationic tail current in rat cortical pyramidal cells"Eir. J. Neurosci.. 11. 2397-2402 (1999)