カサノリに存在するイオン能動輸送系に関する分子生物学的研究-カサノリCL^-輸送性ATPase,H^+-PPase及びV-ATPaseについて-

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09640780
• Research Institution: Okayama Prefectural University
• Principal Investigator: 池田 己喜子 岡山県立大学, 保健福祉学部, 教授 (20112154)
• Keywords: カサノリ(Acetabularica) / CL^-輸送性ATPase / ABC transporter / H^+-PPase / V-ATPase / 遺伝子クローニング / 発現

Research Abstract

1.カサノリ V-PPase の酵母細胞での発現
cDNAクローニングにより得たV-PPase gene(AcVP)を酵母発現ベクター、pKTΔATG(GAP promoter)及びpYES2(GAL1 promoter)に組み込んだrecombinantを作成した。これらをS.cerevisiae BJ5459 strain (protease(-)株)及び protease(+)株に導入し、 transformants を得た。このうち、発現量の最も多かったpYES系/BJ5459strain の transformantを培養し、細胞を回収、 membrane fraction を調製した。C12E9で発現PPaseを可溶化後、Phenyl-Superose及びMono Qクロマトグラフィーにより部分精製を行った。発現PPase のPPaseとしての性質を調べた結果、カサノリ粗液胞膜画分及びそれから部分精製した標品の示す性質と類似するものであった。また、membrane fractionからvesicleを調製し、acridine orangeの蛍光quenching測定によりPPi依存性のプロトン輸送活性を証明した。
2.カサノリ V-ATPase,proteolipid subunit の6種類の cDNA の酵母細胞での発現
これまでに、上記subunitをコードするcDNA6種をクローニングした(AACEVAPD 1ー6)。これらのcDNAを酵母発現ベクターpESC-Leuに連結し、AACEVAPD2,4及び5についてrecombinantを得た。これらを、酵母V-ATPase,proteolipid subunit欠損株(vma3-deficient strain)に導入し、transformantを得た。培養後、酸性小器官へのキナクリンの取り込みを蛍光顕微鏡で観察した。それぞれのtransformantで蛍光がみられ、カサノリV-PPase,proteolipid subunitの発現並びに機能のcomplementationが実証された。
3.カサノリ ABC transporterのcDNAクローニング
生体膜を介する溶質の選択的な移動を媒介するATP-binding cassette(ABC)superfamilyのcDNAクローニングの結果、sulfate permeaseのCysA subunitの全長をコードするcDNAを得た。357アミノ酸をコードし、分子量40,679の蛋白質であり、シアノバクテリアCysA proteinに48.7%のidentityを示すものであった。即ち、バクテリアタイプの構造を有することが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Ikeda,M.et al.: "The Primary Structure of the Cl^--Translocating ATPase,a Subunit(AB12085) of Acetabularia acetabulum"Plant Physiology(PGR98-097). 117. 718 (1998)
• [Publications] Ikeda,M.et al.: "A Vacuolar H^+-Pyrophosphatase in Acetabularia acetabulum : molecular cloning and comparison with higher plants and a bacterium"Journal of Experimental Botany. 50・330. 139-140 (1999)
• [Publications] Nakanishi,Y.et al.: "Molecular Cloning and Sequencing of the cDNA for Vacuolar H^+-Pyrophosphatase from Chara corallina"Biochim.Biophys.Acta. 1418. 245-250 (1999)
• [Publications] Ohmori,S.et al.: "Saccharomyces cerevisiae Cultured under Aerobic and Anaerobic Conditions: air-level oxygen stress and protection against stress"Biochim.Biophys.Acta. 1472. 587-594 (1999)
• [Publications] Ikeda,M.et al.: "Molecular Cloning and Sequencing of the cDNA for CysA protein of Sulfate Permease from Acetabularia acetabulum"Plant Cell Physiology. (in press). (2000)