新しい炭素-硫黄結合の形成と開裂反応を触媒する酵素の機能解析とその応用

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09650877
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 和泉 好計 鳥取大学, 工学部, 教授 (40026555)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大城 隆 鳥取大学, 工学部, 助手 (00233106)
• Keywords: ビオチン / BioB / bioB / ビオチンアナログ / ジベンゾチオフェン / 脱硫菌 / DszA / DszC

Research Abstract

本研究の研究実績は次のようにまとめられる。
1.ビオチン合成酵素に関する研究
ビオチン合成酵素BioBを高発現するBacillus sphaericusのbioB組換え株の無細胞抽出液から2種類のアフィニティクロマトグラフィーによってBioBを高収率でかつ高純度で精製することができた。この精製酵素を用いてビオチンアナログであるチオフェン吉草酸(TVA)およびアシドマイシン(ACM)のビオチン合成酵素反応に対する阻害効果を検討した結果、それぞれ20mMおよび10mMで酵素反応を完全に阻害することを見いだした。本菌のbioB遺伝子はもともとTVA、ACM耐性変異を付与された菌株から得られた遺伝子であるので変異のかかっていない遺伝子の組換え株の酵素に対する影響と比較する必要があると思われた。
2.DBT脱硫酵素系酵素蛋白質の精製と特性の解析
DBTオキシゲナーゼ(DszC)及びDBT-sulfoneオキシゲナーゼ(DszA)を精製すると共にこれらオキシゲナーゼ反応にはreductaseが関与することを明らかにした。
特にDBTから2-HBPへの反応を触媒するDszAについてはDBT脱硫菌Rhodococcus erythropolis D-1株より大量の精製酵素の調製を行った。すなわち湿菌体量約100gのR.erythropolis D-1株を10% glycerol及び1mM DTTを含む50mM Tris-HCl buffer(pH8.0)に懸濁し、超音波破砕を行い、上清を無細胞抽出液とした。そして、DEAE-Sepharose Fast Flowカラムクロマトグラフィーに通し、DszA、B、C及びreductaseを分離した。その後、疎水相互作用、陰ECオン交換、ゲルろ過の各種クロマトグラフィーを用いてDszAの精製を行った。その結果、ほぼ単一な酵素が得られ、結晶化することにも成功した。

Research Products

• [Publications] Yoshikazu Izumi: "Dibenzothiophene(DBT)oxygenase responsible for the first step of DBP desulfurization by Rhodococcus erythropolis D-1--Prification and characterization" Journal of Ferrmentation and Bioengineering. 33,2. 233-237 (1997)
• [Publications] Yoshikazu Izumi: "Microbial desulfurization of dibcnzothiophcne and its derivativcs" American Chemical Society,preprints of the Fucl Division. 42,2. 761-765 (1997)