種特異的プライマーを用いたPCR法による植物芽内からのうどんこ病菌の検出

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09660055
• Research Institution: College of Technology, Toyama Prefectural University
• Principal Investigator: 佐藤 幸生 富山県立大学短期大学部, 助教授 (20104979)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高松 進 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (20260599)
• Keywords: うどんこ病菌 / サルスベリうどんこ病 / 種特異的プライマー / PCR法

Research Abstract

1 作成したサルスベリうどんこ病菌(サルスベリ菌)の種特異的プライマーの特異性および検出限界の検討:特異性を高めるためにPCRのアニリング温度について検討した結果、1)アニリング温度を58℃から73℃の間であげても特異性は改善されなかった。しかし、2)2回かけていたPCRを1回にすると、増幅しなくなる菌類があり、PCRの増幅回数の減少により特異性が高まった。また、制限酵素Xho Iを用いたPCR-RFLPを検討し、サルスベリ菌の検出に本制限酵素は有効なことを明らかにし、種特異的プライマーとXho I処理の組み合わせは、サルスベリ菌の特異的検出に有効であることを示した。さらに、サルスベリ菌の検出限界について検討した結果、プライマーの組み合わせによっても異なるが、サルスベリ菌のDNA濃度が、275μg/m1有れば検出できることを明らかにした。
2 自然条件下でのうどんこ病菌の芽内への感染と発病経過:サルスベリからのDNA抽出は、キアゲンカラムを用いる方法が有効なことを先に明らかにした。本法を自然条件下で発病したサルスベリうどんこ病発葉に適用し、その後、1)そのまま種特異的プライマーを用いてPCR増幅したが、サルスベリ菌のDNAは増幅されなかった。そこで、2)先にキレックス法でサルスベリ菌DNAの抽出を試みた後に、キアゲンカラムを用いる方法を検討したが、PCRが阻害され、サルスベリ菌のDNAは増幅しなかった。以上の結果、サルスベリ菌検出のためには、発病葉を用いたPCR増幅条件をさらに検討する必要が明らかとなった。

Research Products

• [Publications] 佐藤幸生: "日本産うどんこ病菌をめぐる最近の話題"植物防疫. 53(5). 185-194 (1999)
• [Publications] Takamatsu S., Hirata T., Sato Y., Nomura Y.: "Phylogenic relationships of Microsphaera and Erysiphe (powdery mildew) inferred from the rDNA JTS sequences"Mycoccience. 40. 259-268 (1999)
• [Publications] Mori Y., Sato Y., Takamatsu S.: "Evolutionary analysis of the powdery mildew fungi using nucleotide sequences of the nuclear ribosomal DNA"Mycologia. 92(1). 74-93 (2000)
• [Publications] Sato Y., Takamotsu S.: "Taxonomical study on powdery mildews based on morphological characters of conidial stage and molecular analysis"The first international powdery mildew conference. 17-18 (1999)