DNAファイバーFISH法による動物ゲノムの複製単位の同定とその解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09660080
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 奥村 克純 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (30177183)
• Keywords: FISH / DNA fiber / PWS / AS / DNA replication / replication timing / intranuclear structures

Research Abstract

本研究は、DNA複製中の領域をin situで直接視覚化し、ファイバーFISHを導入することで直接的にマップして、動物ゲノムの複製を検討した。まず、ヒトMHCゲノム領域の複製について検討した。HL60細胞を同調培養し、ブロモデオキシウリジン(BrdU)を添加し、2時間リリース後、Fiber標本を作製し、MHCに存在する2種のコスミドクローン(HL60細胞ではTNFはS期一時間後、KS43はS期の3-4時間に複製)でそれぞれFISHを行い、BrdUとプローブを異なる色で同時検出した。80%以上の割合で、TNFがBrdU上にある一方、KS43の大部分はBrdU上に検出されなかった。以上の結果はBrdU検出によって、クローン間の複製順序が直接的に判定し得ることを示している。Fiber-FISHによって複製の有無を検出する基本的な方法は確認できたが、細胞周期の同調の程度が、問題となる。そこで、同調培養法を検討し、HL60ではアフィジコリン2回同調によれば、80%程度同調できることを見出した。今後、動物細胞系ではこれを用い、定量的DNAファイバーFISH法を利用し、複製部位の検出系に応用する予定である。一方で、PWS/AS領域の核内挙動の解析と複製タイミング変化点の同定について検討した。SNRPNは細胞周期に関係なく、15番染色体テリトリ-の周辺、しかも核膜近くに存在することが三次元イメージングで明らかとなった。また、S期後期にSNRPNとセントロメアが近接して存在し、S期後期では複製ドメインが核内で近接する可能性を提示した。さらに、PWS/AS領域の父方が早期に複製する領域と母方が早期に複製する領域の変化する境界を決定を試みたが、数十キロにわたって決まらないという結果を得た。これは新たな複製制御の可能性を意味する。また、複製の非同調性にはヒストンのアセチル化の関与が示唆され、一旦、非同調性が解除されると、これが何世代にもわたって受け継がれることを見出した。

Research Products

• [Publications] Takayuki Hattori: "Molecular Cloning of a cDNA Encoding Human TSC-22 (Transforming Growth Factor β1-Stimulated Clone 22) and Localization of the Gene at Chromosome 13q14." Acta Sholae Medicinalis Universitatis in Gifu. 45巻. 201-208 (1997)
• [Publications] Nobuhisa Mizuki: "Nucleotide Sequence Analysis of the HLA Class I Region Spanning the 237 kb Segment Around the HLA-B and -C Genes." Genomics. 42巻. 55-66 (1997)
• [Publications] Toyoaki Tenzen: "Precise Switching of DNA Replication Timing in the GC Content Transition Area in the Human Major Histocompatibility Complex." Molecular and Cellular Biology. 17巻. 4043-4050 (1997)
• [Publications] Masamichi Ishiai: "Isolation of Human and Fission Yeast Gene Homologues of the Budding Yeast Origin Recognition Complex Subunit Orc5 : Human Homologue (ORC5L) Maps to 7q22." Genomics. (印刷中).
• [Publications] Toshihiko Eki: "Mapping of the Human Genes Encoding Cyclin H (CCNH) and the CDK-activating Kinase (CAK) Assembly Factor NAT1 to Chromosome Bands 5q13.3-q14 and 14q23, Respectively" Genomics. (印刷中).
• [Publications] Masashi Kimura: "Assignment of the STK6 to Human Chromosome 20q13.2-13.3 and a Pseudogene to 1q41-42." Cytogenetics and Cell Genetics. (印刷中).
• [Publications] Chee-Gun Lee: "Molecular Analysis of the cDNA and genomic DNA encoding Mouse RNA Helicase A." Genomics. (印刷中).
• [Publications] Sachiko Kitanaka: "Isolation of human 25-hydroxyvitamin D3 1α-hydroxylase gene and its mutations causing vitamin D-dependent rickets type I." New England Journal of Medicine. (印刷中).
• [Publications] Katsuzumi Okumura: "Temporal Order of DNA Replication of Imprinted IGF2 Gene and Non-imprinted TNF and RFC5 Genes in Human Lymphocytes." Bulletin of the Faculty of Bioresources Mie University. (印刷中).
• [Publications] Yasushi Taniguchi: "Nucleotide Sequence of the Ring3 Gene in the Class II Region of the Mouse MHC and Its Abundant Expression in Testicular Germ Cells." Genomics. (印刷中).
• [Publications] 奥村克純: "FISHによる動物細胞ゲノムの核内構造解析の現状." 生化学. 65巻. 41-46 (1997)