DNAファイバーFISH法による動物ゲノムの複製単位の同定とその解析

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09660080
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 奥村 克純 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (30177183)
• Keywords: FISH / Replicon / DNA fiber / Bromodeoxyuridine / DNA replication / Chromatin structure

Research Abstract

本年度は、真核性染色体のもつ特徴であるマルチレプリコンの複製開始制御機構を明らかにするための新しい解析技術を、蛍光in situ hybridization(FISH)法を駆使して確立することを目指し、以下のように展開した。まず、ファイバーFISHによるレプリコン解析法の開発を行った。DNAファイバー上でのBrdU検出とFISHを併用することにより、数kbの解像度をもつ複製の進行過程を数百kbの範囲で個々の細胞で視覚的に追跡できる。本年度は、BrdUとFISHによるDNAの同時検出には成功したが、安定したシグナル検出のため、本法の技術的基盤を見直した。ファイバー検出時のDNAの変性方法を種々検討した結果、アルカリ条件下で変性させることによって、分断の少ないライン状シグナルとして検出することに成功した。また、この変性条件下で検出したDNAのFISHシグナルもライン状に検出できた。ヒトHL60細胞をGI/S期に同調して、リリースとともにBrdUを取り込ませ、10-30分の間で時間に依存して複製鎖が進行することを安定したシグナルで確認できた。BrdUに続いてヨードウリジンを取り込ませる複製鎖のbidirectionalな検出にも成功した。BrdUとFISHの両者の同時検出にも成功した。今回の技術改良により、ヒトゲノム上のレプリコン・レプリコンクラスタードメインの初の提示が可能となろう。さらに、DNA複製前の核内のゲノムのパッケージング状態を、haIo核標本に対してFISHを行うことにより解析し、インプリント遺伝子SNRPNでは発現している父親由来アレルがコンパクトにパッケージングされていることを示した。この結果は、転写されるアレルが複製前には強くパッケージングされていることを示唆している。SNRPNは父方アレルが母方アレルより先に複製することから、これらの結果は、この領域の複製機構を明らかにする上で極めて重要な知見である。

Research Products

• [Publications] Chee-Gun Lee: "Molecular Analysis of the cDNA and Genomic DNA Encoding Mouse RNA Helicase A" Genomics. 47巻. 365-371 (1998)
• [Publications] Sachiko Kitanaka: "Inactivating Mutations in the 25-Hydroxyvitamin D3 1α-Hydroxylase gene in Patients with Pseudovitamin D-Deficiency Rickets" New England Journal of Medicine. 338巻. 653-661 (1998)
• [Publications] Katsuzumi Okumura: "Temporal Order of DNA Replication of Imprinted IGF2 Gene and Non-imprinted TNF and RFC5 Genes in Human Lymphocytes" Bulletin of the Faculty of Bioresources Mie University. 20号. 47-54 (1998)
• [Publications] Yasushi Taniguchi: "Nucleotide Sequence of the Ring3 Gene in the Class II Region of the Mouse MHC and Its Abundant Expression in Testicular Germ Cells" Genomics. 51巻. 114-123 (1998)
• [Publications] Toshihiko Eki: "Assignment of the Human Homologue of the Yeast Origin Recognition Complex Subunit ORC4 to Human Chromosome Band 2q22-q23 by in situ Hybridization and Somatic Cell Hybrid Analysis" Cytogenetics and Cell Genetics. 81巻. 89-90 (1998)
• [Publications] Noriyuki Yanaka: "Expression,Structure and Chromosomal Localization of the Human cGMP-binding cGMP-specific Phosphodiesterase Gene(PDE5A)" European Journal of Biochemistry. 25巻. 391-399 (1998)
• [Publications] Takashi Shiina: "Physical Mapping between the S and HLA-E Genes in the Human MHC Class I Region:Construction of a BAC,PAC and Cosmid Contig" Immunogenetics. 48巻. 402-407 (1998)
• [Publications] Katsuzumi Okumura: "Chromosomal Localization of Human DNA-binding Nuclear Protein(NP220)to 2P13.1-p13.2 by Fluorescence in situ Hybridization" Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 62巻. 1640-1642 (1998)
• [Publications] Shin Ogata: "Apoptosis Induced by Niacin-related Compounds in HL-60 Cells" Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 62巻. 2351-2356 (1998)
• [Publications] Takeshi Uchiumi: "Isolation of Novel Human Canalicular Multispecific Organic Anion Transporter,cMOAT2/MRP3 and Its Expression in Cisplatin Resistant Cancer Cells with Decreased ATP-dependent Drug Transport" Biochemical Biophysical Research Communications. 252巻. 103-110 (1998)
• [Publications] Shin Ogata: "Effects of Poly(ADP-ribose)polymerase Inhibitors and NAD on the Apoptosis Induced by Actinomycin D in Human Leukemia Cells HL-60" Bulletin of the Faculty of Bioresources Mie University. (印刷中).
• [Publications] Masato Tsurudome: "Primary Structure of the Light Chain of FRP-1/CD98/4F2 Predicts a Protein with 11 Transmembrane Domains" Journal of Immunology. (印刷中).